فصل سوم: مواد و روشها

 

1-3- موادو روشها————- 25

 

2-3- تهیه عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه—- 27

 

3-3- حیوانات آزمایشگاهی—— 28

 

1-3-3- نحوه گروهبندی:——- 28

 

2-3-3- روش القای دیابت تجربی:—————- 29

 

3-3-3- اندازه گیری قند و وزن موشها:———— 29

 

4-3-3- مراحل انجام تشریح:—- 29

 

4-3- بررسی بیان ژن———- 31

 

1-4-3- مشخصات توالی ژن PFK-1————- 31

 

2-4-3- طراحی پرایمرها——- 35

 

3-4-3- آماده سازی پرایمر—– 35

 

5-3- استخراج RNA:———- 36

 

1-5-3- استخراج RNA از نمونه های تازه کبد توسط کیت Geneall Hybrid Rtm

 

1-5-3- بررسی کمیت و کیفیت RNA  استخراج شدهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 38

 

6-3- سنتز cDNA————

 

1-6-3- سنتز cDNA توسط کیتThermo SCIENTIFICبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—-

 

7-3- واکنش های PCR——–

 

1-7-3 – PCR شیب دمایی—– 41

 

2-7-3- PCR معمولی——— 43

 

8-3- الکترفورز————— 45

 

1-8-3 – مواد مورد نیازجهت تهیه ژل الکتروفورز—- 45

 

1-1-8-3- آگارز————– 45

 

2-1-8-3- اتیدیوم بروماید—— 46

 

3-1-8-3- لودینگ بافر——— 46

 

4-1-8-3-طرز تهیه محلول Tris-Hcl————-

 

4-1-8-3- شناساگرهای اندازهDNA————–

 

9-3- روش کار با ژل الکترفورز— 47

 

10-3- رسم منحنی استاندارد:— 48

 

10-3- واکنش Real-Time PCR—————-

 

11-3- Threshold و مقدار CT:–

 

12-3- تعیین توالی محصولات  (Direct Sequencing) PCRبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———

 

10-2-3- آنالیز بیان ژن——– 52

 

13-3- تجزیه وتحلیل داده ها—- 52

 

 

فصل چهارم: نتایج و بحث

 

1-4- جمع آوری نمونه :——– 54

 

2-4- بررسی نتایج وزن موشهای مورد مطالعه——- 54

 

3-4- بررسی نتایج گلوکز ناشتای سرم موشهای مورد مطالعهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———- 56

 

5-4- نتایج استخراج RNA:—–

 

6-4- نتایج حاصل ازساخت cDNA بر روی ژل آگاروزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————— 59

 

7-4-  نتایج تعیین غلظت و کیفیت RNA توسط اسپکتروفتومتریبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 61

 

1-7-4-  نتایج مربوط به PCR شیب دمایی——– 61

 

8-4- نتایج منحنی استاندارد—- 62

 

1-8-4- منحنی استاندارد ژن TBP—————

 

2-8-4-منحنی استاندارد ژن PFK-1————-

 

9-4- نتایج واكنش  Real Time PCR————-

 

1-9-4- تکثیر ژنPFK———

 

2-9-4-تکثیر ژن TBP———

 

10-4- ارزیابی  کارایی تکثیر ژنهای مور مطالعه از طریق آنالیز منحنی ذوب:—— 66

 

1-10-4- منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن  PFKبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———–

 

2-10-4-منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن TBPبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————-

 

11-4-  آنالیز منحنی ذوب ژن PFK————–

 

12-4-آنالیز منحنی ذوب ژن TBP—————

 

13-4- نتایج حاصل از Real timePCR ژن PFK 1 بر روی ژل آگارزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد— 70

 

14-4- نتایج بررسی بیان ژن PK—————- 70

 

15-4- بحث:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 71

 

16-4- پیشنهادات————- 73

 

منابع:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 75

 

چکیده:

 

دیابت قندی یكی از مشكلات مهم پزشكی در همه كشورها می‌باشد. امروزه، درد و رنج انسان نه تنها در مورد این بیماری به خودی خود، بلکه شامل عوارض مرتبط با دیابت است.  گیاهان نشان دهنده منبع عظیمی از مکمل­های غذایی بالقوه مفید برای بهبود کنترل قند خون و جلوگیری از عوارض دراز مدت دیابت هستند. با توجه به تنوع گیاهان داروئی در ایران و با توجه به پتانسیل درمانی گیاهان داروئی و همچنین خطراتی كه داروهای شیمیایی ممكن است در حال حاضر یا آینده برای بیماران ایجاد كنند، با بررسی تاثیر گیاهان دارویی در بیماری دیابت می­توان راه­های درمان مناسبی در پیش رو قرار داد.آنزیم  فسفو فروکتوکیناز -1 از آنزیمهای سیتوزولی در مسیر گلیکولیز می باشد که نقش کلیدی در روند تنظیم گلیکولیز دارد.عوارض ناشی از نقص موروثی آنزیم pfk-1 در عضلات اسکلتی بصورت خستگی و کاهش توان حرکات عضلانی می باشد. در مواردی هم نقص آن باعث رشدسریع سلولهای سرطانی می شود. درتحقیق حاضر به  تاثیر عصاره هیدر الکلی برگ گیاه جغجغه (با توجه به دارا بودن اثرات ضدالتهابی، ضد میکروبی و ضد دیابتی ) بر بیان ژن pfk-1در موشهای دیابتی نوع 1می پردازیم.

 

در این مطالعه 45 سر موش صحرایی نر به طور تصادفی در سه گروه شاهد سالم، شاهد دیابتی و دیابتی تحت تیمار تجویز عصاره جغجغه تقسیم شدند. با تزریق استرپتوزوتوسین (mg/kg 60) در موش­های صحرایی نر (300-150 گرم) دیابت نوع 1 ایجاد شد.گروه دیابتی تحت تیمار به صورت روزانه (mg/kg 300) عصاره برگ گیاه جغجغه را به صورت گاواژ به مدت 30 روز دریافت نمودند. گروه شاهد سالم و شاهد دیابتی آب مقطر دریافت کردند. سپس در روز قبل از تجویز عصاره و روزهای 15 و 30 بعد از تجویز عصاره میزان گلوکز خون اندازه­گیری شد و بیان ژن PFK-1 بافت کبدی توسط روش Real-Time PCR بررسی گردید. نتایج نشان داد گلوکز خون در روز 15کاهش می یابد اما بین گروه شاهد دیابتی و دیابتی تحت تیمار تفاوت معنی داری مشاهده نشد میزان بیان ژن PFK در گروه دیابتی تحت تیمار در روز 15 تفاوت معنی داری نسبت به شاهد دیابتی ندارد در بین گروهها تفاوت معنی داری برای بیان ژنPFK  وجود ندارد. بنابراین تجویز عصاره هیدروالکی گیاه جغجغه بر بیان ژن فسفوفروکتوکیناز -1 در بیماران دیابتی نوع 1 بی تاثیر می باشد.

 

فصل اول: مقدمه و کلیات

 

1-1- مقدمه

 

دیابت یک بیماری ساده نیست، بلکه سندرم پیچیده­ای است که بارزترین ویژگی آن افزایش قند خون است. بنابراین، بیماران دیابتی هر چند در یک ویژگی به هم می­مانند، اما هم از نظر بالینی و هم از نظر آسیب شناسی و ژنتیکی ناهمگون هستند. این بیماری در سال 1980 میلادی این گونه تعریف شد: گروهی از نارسایی­ها که ویژگی اصلی آن­ها افزایش بیش از اندازه­ی گلوکز در خون و کاهش تحمل به گلوکز است و پیامد کمبود انسولین یا نارسایی در کارکرد انسولین و یا آمیزه­ای از این دو است. عوارض ناشی از دیابت در 25% موارد، نارسایی کلیه و در 50% موارد قطع عضو و نابینایی است (Tehranipour et al., 2008). گیاهان دارویی از قدیم به منظور کنترل قند خون، کاهش عوارض، افزایش کیفیت و طول زندگی در افراد دیابتی به کار گرفته شده است. با توجه به این که گیاهان دارویی نسبت به داروهای شیمیایی اثر جانبی کمتری دارند، بنابراین پژوهشگران به دنبال یافتن ترکیبهای گیاهی برای درمان و یا پیشگیری از این بیماری هستند. گیاه جغجغه (Prosopis farcta) گیاهی با خواص ضد التهاب و ضد دیابتی است. اهمیت فعالیت فسفوفروکتوکیناز 1 نه تنها از این جنبه است که واکنشی به شدت انرژی زا را کنترل می کند بلکه اولین مرحله در واکنش­های گلیکولایزیز است که واکنش یکطرفه بوده و برگشت ناپذیر است. این باعث می­گردد که کنترل شدیدی بر روی میزان گلوکز و دیگر مونوساکاریدها مانند گالاکتوز و فروکتوز بوجود آید.. هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر میزان بیان ژن پیروات کیناز و کاهش سطح گلوکز خون در موش‌های صحرایی نر دیابتی می‌باشد.

 

 

1-13) ماکرولیدها………………………………………………………………………………27

 

1-14) اریترومایسین، ساختمان و ویژگی ها…………………………………………………30

 

1-15) تاریخچه تولید اریترومایسین………………………………………………………….31

 

1-16) نام ها و فرمول شیمیایی اریترومایسین……………………………………………32

 

1-17) مکانیسم عمل اریترومایسین………………………………………………………..32

 

1-18) فعالیت ضد میکروبی اریترومایسین…………………………………………………33

 

1-19) فارماکوکینتیک………………………………………………………………………….34

 

1-20) مصارف بالینی اریترومایسین………………………………………………………….34

 

1-21) عوارض جانبی اریترومایسین………………………………………………………….35

 

1-22) اشکال دارویی اریترومایسین…………………………………………………………..36

 

1-23) آنتی بیوتیک های مشتق شده از اریترومایسین…………………………………..36

 

1-24) مراحل کلیدی فرآیند تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین……………….38

 

1-24-1) حفظ و نگهداری کشت فعال…………………………………………………………39

 

1-24-2) تهیه مایه تلقیح به فرم سوسپانسیون اسپوری و توسعه آن…………………..44

 

1-24-3) مرحله پیش کشت یا بذردهی یا seeding …………………………………….

 

1-24-4) مرحله تخمیر یا Fermentation ………………………………………………….

 

1-24-4-1) تکنولوژی تخمیر آنتی بیوتیک……………………………………………………..48

 

1-24-4-1-1) تخمیر شیک فلاسک……………………………………………………………….48

 

1-24-4-1-2) فرمانتورهای همزن دار………………………………………………………….49

 

1-24-4-2) بررسی تأثیر عوامل مختلف برروی تخمیر و تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین…50

 

1-24-4-2-1) تأثیر محیط کشت تخمیر و ترکیبات مورد استفاده در آن………………………50

 

1-24-4-2-1-1) منابع کربنی………………………………………………………………………51

 

1-24-4-2-1-2) منابع نیتروژنی…………………………………………………………………..55

 

1-24-4-2-1-3) آب…………………………………………………………………………………57

 

1-24-4-2-1-4) مواد معدنی……………………………………………………………………..57

 

1-24-4-2-1-5) مواد مغذی پیچیده………………………………………………………………59

 

1-24-4-2-1-6) ویتامین ها و فاکتورهای رشد…………………………………………………..61

 

1-24-4-2-1-7) پیش ماده ها……………………………………………………………………..61

 

1-24-4-2-1-8) القا کننده ها و تحریک کننده ها……………………………………………….61

 

1-24-4-2-2) تأثیر pH……………………………………………………………………………..

 

1-24-4-2-3) تأثیر دما……………………………………………………………………………..64

 

1-24-4-2-4) تأثیر هوادهی………………………………………………………………………..67

 

1-24-4-2-5) تأثیر هم زدن………………………………………………………………………..68

 

1-24-4-2-6) تأثیر دی اکسید کربن……………………………………………………………..71

 

1-24-4-2-7) تأثیر کف…………………………………………………………………………….71

 

1-24-4-2-8) تأثیر استریلیزاسیون……………………………………………………………….73

 

1-24-4-2-9) تأثیر ویسکوزیته…………………………………………………………………..74

 

1-24-4-2-10) تأثیراریترومایسین تولید شده…………………………………………………..76

 

1-24-5) برداشت و خالص سازی محصول………………………………………………………77

 

1-25) سویا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی………………………………..79

 

 

1-25-1) علل انتخاب سویا و توسعه کشت آن…………………………………………………..79

 

1-25-2) تاریخچه سویا…………………………………………………………………………….80

 

1-25-3) تولید و مصرف جهانی سویا………………………………………………………………81

 

1-25-4) سویا در ایران……………………………………………………………………………82

 

1-25-5) اجزای ترکیبی سویا……………………………………………………………………..82

 

1-25-6) کنجاله سویا………………………………………………………………………………83

 

1-26) کلزا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی………………………………..83

 

1-26-1) علل عمده انتخاب کلزا و توسعه کشت آن…………………………………………….84

 

1-26-2) تاریخچه کلزا……………………………………………………………………………..85

 

1-26-3) تولید جهانی کلزا…………………………………………………………………………86

 

1-26-4) اجزای ترکیبی کلزا………………………………………………………………….86

 

فصل دوم : مروری بر متون گذشته

 

2-1) پیشینه پژوهش……………………………………………………………………………88

 

فصل سوم : مواد و روش ها

 

3-1) روش گردآوری اطلاعات و انجام پژوهش…………………………………………………..93

 

3-2) سویه باکتری مورد استفاده در پژوهش…………………………………………………..93

 

3-3) معرفی رنگ های مورد استفاده…………………………………………………………….94

 

3-4) محیط های کشت مورد استفاده…………………………………………………………..95

 

3-4-1) محیط کشت اسپورزایی………………………………………………………………….95

 

3-4-1-1) تهیه سوسپانسیون اسپوری…………………………………………………………98

 

3-4-2) محیط کشت مرحله بذردهی( پیش کشت_ seeding)……………………………….99

 

3-4-2-1) انتخاب بهترین ارلن در مرحله بذردهی…………………………………………….100

 

3-4-3) محیط کشت مرحله تخمیر………………………………………………………………104

 

3-4-3-1) غلظت های کنجاله سویا و کنجاله کلزا مورد استفاده شده در محیط تخمیر…….105

 

3-5) نمونه گیری…………………………………………………………………………………..106

 

3-6) سنجش اریترومایسین تولید شده………………………………………………………106

 

3-6-1) تهیه بافر کربنات بی کربنات با pH 6/9 ……………………………………………..

 

3-6-2) تهیه بافر با pH 6/9 اشباع از کلروفرم و کلروفرم اشباع از بافرpH 6/9 …………….

 

3-6-3) تهیه بافر سیترات_فسفات با pH 2/4………………………………………………

 

3-6-4) تهیه محلول بروموفنل بلو…………………………………………………………….108

 

3-6-5) تهیه محلول های استاندارد اریترومایسین………………………………………….109

 

3-6-6) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر با استفاده از کلروفرم…………………….111

 

3-6-7) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو……………………………112

 

3-6-8) اندازه گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو…………113

 

3-7) محیط کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین…………………………..113

 

3-7-1) محیط کشت مولر هینتون آگار………………………………………………………113

 

3-7-2) محیط کشت مولر هینتون براث…………………………………………………….114

 

3-7-3) استخراج اریترومایسین از محیط کشت تخمیر……………………………………..114

 

3-7-4) سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین………………………………………………..114

 

3-7-5) تهیه مایع تلقیح…………………………………………………………………………115

 

3-7-6) تهیه چاهک………………………………………………………………………………116

 

3-7-7) تهیه بافر فسفات با pH 8……………………………………………………………..

 

3-7-8) تهیه محلول های استاندارد…………………………………………………………..116

 

3-7-9) افزودن محلول های آنتی بیوتیک در پلیت ها……………………………………….117

 

3-7-10) اندازه گیری قطر هاله مهار رشد………………………………………………..117

 

3-7-11) رسم منحنی استاندارد………………………………………………………………117

 

3-8) سنجش غلظت اریترومایسین به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا…………….118

 

3-8-1) فاز متحرک………………………………………………………………………………..118

 

3-8-2) آماده سازی مایع تخمیر…………………………………………………………………118

 

3-8-3) اندازه گیری مقداراریترومایسین…………………………………………………………119

 

3-9) کروماتوگرافی لایه نازک TLC ……………………………………………………………..

 

فصل چهارم: نتایج پژوهش

 

4-1) بررسی اثر کنجاله سویا بر رشدSaccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین (محیط شاهد)…123

 

4-1-1) اثر کنجاله سویا در pH محیط کشت تولید اریترومایسین (کنترل)…………………….123

 

4-1-2) اثر کنجاله سویا بر درصد بیومس تولید شده (کنترل)……………………………….124

 

4-1-3) اثر کنجاله سویا در میزان تولید اریترومایسین ( کنترل)………………………………125

 

4-1-4) بررسی اثر کنجاله سویا بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea (کنترل)…125

 

4-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر تولید اریترومایسین…………………128

 

4-2-1) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر pH محیط کشت……………………129

 

4-2-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر بیومس تولیدی……………………130

 

4-2-3) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر میزان اریترومایسین تولیدی……….130

 

4-3) غلظت بهینه ترکیب کنجاله سویا و کلزا برای محیط کشت تولید اریترومایسین…………131

 

4-4) اثر ترکیب کنجاله سویا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر و کنجاله کلزا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر بر روی پارامترهای مورد بررسی درتخمیر………32

 

4-4-1) بررسی اثر غلظت بهینه در میزان تولید اریترومایسین………………………………….132

 

4-4-2) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی pH محیط کشت تخمیر……………………………….133

 

4-4-3) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی درصد بیومس تولیدی………………………………..133

 

4-4-4) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea………

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

 

5-1) تأثیر مواد تشکیل دهنده و ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک…137

 

5-1-1) اثر منابع نیتروژنی در تولید اریترومایسین…………………………………………………..137

 

5-1-1-1) مقایسه اثر غلظت های مختلف ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا به عنوان منبع نیتروژنی در تولید اریترومایسین…..138

 

5-2) همزمانی رشد Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین………………….144

 

5-3) رابطه بین میزان رشد باکتری و تغییرات بیومس در طول فرآیند……………………………145

 

5-3-1) سینتیک رشد میکروبی……………………………………………………………………..146

 

5-4) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده در این پژوهش و pH محیط کشت تخمیر………148

 

5-5) رابطه بین مورفولوژی سویه مولد و تولید اریترومایسین………………………………….149

 

5-6) برآورد هزینه ها………………………………………………………………………………..153

 

5-6-1) محاسبه میزان اریترومایسین تولیدی و قیمت تمام شده منبع نیتروژنی مورد استفاده در آن در هر Batch صنعتی….153 

 

5-6-1-1) استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا (محیط کنترل) در تخمیر……………………154

 

5-6-1-2) استفاده از ترکیب 15 گرم در لیتر کنجاله سویا و 15 گرم در لیتر کنجاله کلزا……..154

 

5-7) پیشنهادات………………………………………………………………………………………156

 

منابع و مراجع……………………………………………………………………………………..158

 

خلاصه انگلیسی………………………………………………………………………………….165

 

ضمائم ……………………………………………………………………………………………..166

 

چکیده:

 

امروزه یکی از مهم ترین و پرمصرفترین آنتی بیوتیک های مورد استفاده اریترومایسین می باشد که در درمان طیف وسیعی از بیماری ها مورد استفاده قرار می گیرد. برای تولید این آنتی بیوتیک پنج مرحله کلیدی وجود دارد که از بین این مراحل، مهم ترین و پر هزینه ترین مرحله که در آن اریترومایسین تولید می شود مرحله تخمیر است. ترکیبات محیط کشت مرحله تخمیر  نقش مهمی را در میزان تولید محصولات ثانویه و  پارامترهای تخمیر ایفا می کنند همچنین سوبسترای نیتروژنی یکی از اجزای اصلی محیط کشت در این مرحله و یکی از موارد اصلی هزینه در مخلوط محیط کشت می باشد. بنابراین استفاده از منابع نیتروژنی با قیمت مناسب و بازده قابل قبول از اهمیت ویژه ای برخوردار است . در این پژوهش اثرغلظتهای مختلف ترکیبی از دو منبع نیتروژنی کنجاله سویا و کنجاله کلزا در تولید آنتی بیوتیک اریترومایسین بررسی شده است. برای تولید اریترومایسین از باکتری رشته ای Saccharopolyspora erythraea   استفاده شده است. سوسپانسیون اسپوری به محیط بذردهی تلقیح شده و در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 40 تا 44 ساعت با دور rpm 200 در شرایط هوازی گرما گذاری شد و بهترین نمونه بذردهی به ارلن های حاوی محیط تخمیر اضافه شد و با pH اولیه 8/6 در شیکر انکوباتوردار با دمای 33 درجه سانتیگراد و دور rpm220 به مدت 11 روز گرما گذاری شد. در طول فرایند تغییرات مورفولوژیک باکتری ، pH ، درصد وزن تر بیومس تولیدی از روز چهارم به صورت یک درمیان اندازه گیری شد . میزان اریترومایسین تولید شده به روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد . غلظت های منابع نیتروژنی مورد استفاده عبارت بود از :

 

1- کنجاله سویا 15 گرم در لیتر و کنجاله کلزا 15 گرم در لیتر ( هر کدام 50 % محیط )

 

2- کنجاله سویا 18 گرم در لیتر ( 60 % ) و کلزا 12 گرم در لیتر ( 40 % )

 

3- کنجاله سویا 12 گرم در لیتر ( 40 % ) و کلزا 18 گرم در لیتر ( 60 % )

 

4-کنجاله سویا 21 گرم در لیتر ( 70 % ) و کلزا 9 گرم در لیتر ( 30 % )

 

5- کنجاله سویا 9 گرم در لیتر ( 30 % ) و کلزا 21 گرم در لیتر ( 70 % )

 

 بر طبق نتایج بدست آمده، استفاده از مخلوط 15 گرم در لیتر کنجاله سویا و 15 گرم در لیتر کنجاله کلزا ،دارای بالاترین میزان تولید اریترومایسین بوده و نسبت به استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا که حالت مورد استفاده در صنعت می باشد 011/1 برابر اریترومایسین بیشتری تولید نموده است.

 

مقدمه:

 

بیوتکنولوژی دانشی است که در رابطه با استفاده از موجودات و یا متابولیت های آنها جهت تولید فرآورده های مختلف دارویی ، غذایی ، شیمیایی و غیره در مقیاس صنعتی بحت می کند. روند تکاملی بیو تکنولوژی در طی هزاران سال شکل گرفته و نهایتا به علمی تبدیل شد که با جهت گیری کاربردی میکروبیولوژی و بیو شیمیایی ، ارتباط نزدیکی با مهندسی شیمی ایجاد نموده است ( 48 ).

 

بین انسانها و میکرو ارگانیسمها ، از ابتدا ارتباط حیاتی بسیار نزدیکی وجود داشته که این ارتباط می تواند مضر و یا مفید باشد. پس از آنکه رابرت کخ در سال 1880 برای اولین بار کشت خالص باکتری ها را به دست آورد ، توجه زیادی به عوامل بیماری زا شد و مطالعات بعدی نشان داد که با وجود این که برخی میکروبها عامل بیماری در انسان ، حیوان و گیاه هستند ، عده زیاد دیگری کاربرد صنعتی داشته و در تولید مواد غذایی، داروها ، آنزیم ها ، اسید های آمینه و غیره نقش دارند(52).

 

در دهه 1940 و 1950 که آنتی بیوتیکهای اولیه نظیر پنی سیلین کاربرد بالینی پیدا کرده و به عنوان داروهای ایجازگر شناخته شده بودند ، با از بین بردن بسیاری از باکتری ها عامل وخیم ترین بیماری های عفونی انسان ، جان میلیونها تن حفظ شد. اما مدتی پس از کشف آنتی بیوتیک ها ، به دلایل متعدد، از جمله استفاده نادرست و یا بیش از حد از آنها ، مثلا استفاده تنها جهت فربه کردن دام ، سویه های میکرو ارگانیسم در مقابل آنتی بیوتیک ها مقاوم شدند ، بطوریکه امروزه مجددا بیماری های عفونی ناشی از میکرو ارگانیسم ها تهدیدی جدی برای سلامتی در دنیا محسوب شده و هزینه های بسیار زیادی برای درمان آنها مصرف می شود.

 

طی سالهای 1925 تا 1965 استفاده از میکروبها در صنایع دارویی به صورت یک تحول اساسی زمینه را برای بکارگیری میکروارگانیسمها در تولید داروها و بویژه آنتی بیوتیکها فراهم ساخت و با گذشت زمان این روند تکامل یافت به طوری که امروزه بیو تکنولوژی در حال ورود به مرحله جدیدی است و به عنوان یک علم در عصر پیدایش و ساخت آنتی بیوتیکها توسعه چشم گیری داشته و در حال حاضر تولید انبوه فرآورده های میکروبی نظیر  آنتی بیو تیک ها  به صنعت چند میلیارد دلاری مبدل شده و از نقطه نظر اقتصادی ، آنتی بیوتیکها مهم ترین فراورده های صنعتی دنیای میکروبها محسوب می شوند(12).  بدین ترتیب بالا بردن راندمان تولید و اقتصادی تر کردن فرآیند تولید آنتی بیوتیک ها جز اهداف ضروری است که با تلاش متخصصین در شاخه های مختلف علوم نظیر میکرو بیو لوژی ، بیو شیمی، مهندسی شیمی،بیوتکنولوژی و غیره می توان به آن دست یافت. در صنعت بیوتکنولوژی برای تولید محصولاتی نظیر آنتی بیوتیک ها دو بخش عمده وجود دارد :

 

1- عملیات بالا دستی(Up stream ) : که شامل دو بخش توسعه سویه و توسعه محیط کشت و تخمیر است و در این بخش ها نقش مهندسی شیمی و میکروبیولوژیست حائز اهمیت است. هدف از بخش توسعه سویه ، شناخت، تهیه و تثبیت میکروارگانیسم مولد محصول و هدف از بخش توسعه محیط کشت ، بهینه سازی محیط کشت از نظر میزان و نوع مواد، شرایط تولید و اقتصادی تر نمودن فرآیند می باشد.

 

2- عملیات پایین دستی( D. stream) : در این بخش که در واقع فرآوری پس از تخمیر است، نقش مهندسان در جهت دهی فرآیند تخمیر به سمت نتایج بسیار مهم می باشد. هدف از این مرحله، جداسازی و خالص سازی محصول می باشد. ( 17)

 

فصل اول: کلیات

 

 

1-7 ضرورت اهداف تحقیق………………………………………………………… 33

 

فصل دوم: مواد و روش­ها…………………………………………………………… 35

 

2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی……………………………………….. 36

 

2-2 جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ…36

 

2-2-1 طرز تهیه محیط کشت a-MEM…………………………………………….

 

2-2-2 طرز تهیهPBS   فاقد كلسیم و منیزیم (2/7 : PH)………………………. 37

 

2-2-3 طرز تهیه تریپسین/ EDTA…………………………………………………

 

2-2-4 روش جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان……………… 39

 

2-2-5 پاساژ سلولی……………………………………………………………… 39

 

2-3 تأیید هویت سلول‌های استرومایی به روش ایمونوسیتوشیمی………. 39

 

2-3-1 ایمونوسیتوشیمی CD71………………………………………………..

 

2-3-1-1 طرز تهیه پارافرمالدئید 4%…………………………………………….. 41

 

2-3-1-2 طرز تهیه ژلاتین 1/0 درصد…………………………………………….. 41

 

2-3-1-3 ساخت سرم بز 10%…………………………………………………… 41

 

2-3-1-4 طرز تهیه PBS  ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH)……………….. 42

 

2-3-1-5 طرز تهیه بافر گلیسرول………………………………………………….. 42

 

2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز………………………………………………. 43

 

2-4بررسی مارکر عصبی  βIII-tubulin در سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان  به روش ایمونوسیتوشیمی….44

 

 2-5 تایید هویت عصبی نوروسفر­ها به روش ایمونوسیتوشیمی…………… 45

 

2-6 بررسی مولكولی بیان ژن­های اعضای خانواده نوروتروفین……………….. 46

 

2-6-1 استخراج RNA كل از سلول‌های كشت شده …………………………..46

 

2-6-2بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده…………………………….. 48

 

2-6-3 الكتروفورز ژل آگارز …………………………………………………………49

 

2-6-4 واکنش ساخت cDNA (واکنش رونویسی معکوسRT-)……………… 52

 

2-6-5 انتخاب پرایمر……………………………………………………………… 53

 

2-6-6 آماده‌سازی پرایمرها……………………………………………………… 54

 

2-6-7 واكنش PCR……………………………………………………………….

 

2-7 آنالیز آماری………………………………………………………………….. 58

 

فصل سوم: نتایج…………………………………………………………………. 59

 

3-1 مشاهده مورفولوژی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت….59

 

3-2 تعیین هویت سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز….60

 

3-3 ویژگی­های مورفولوژیکی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت….60

 

3-4 تأیید هویت سلول‌های عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی….60

 

3-5 تأیید هویت نوروسفر­ها با استفاده از نشانگر نستین……………….. 61

 

 

3-6 ارزیابی بیان ژن­های فاكتورهای نوروتروفیك و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باند­ها و نمودار­های مربوط به آن…61

 

4-1 نتیجه ­گیری و بحث………………………………………………………… 70

 

4-1 مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آن­ها…71

 

4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلول­های بنیادی مزانشیمی…72

 

4-3 پتانسیل تمایز سلول­های بنیادی مغز استخوان به سلول­های عصبی……74

 

4-4 تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مغز استخوان در كشت طولانی مدت….76

 

4-5 نتیجه گیری…………………………………………………………………… 77

 

پیشنهادات…………………………………………………………………………. 77

 

مراجع ………………………………………………………………………………..79

 

چکیده:

 

هدف : هدف ما در این پژوهش پاسخ به این سوال است که  آیا MSCs  بعد از کشت طولانی مدت می­توانند به طورخود­بخودی به سلول­های پیش­ساز عصبی تمایز یابند.

 

مواد وروش­ها: این تحقیق شامل دو گروه می­باشد: کشت پاساژ پنجم MSCs  در محیط کشت -MEMα و  FBS %10  به مدت سه هفته بدون تعویض محیط یا استفاده از  القاگر به عنوان گروه آزمایشی و پاساژ پنجم MSCs بدون کشت طولانی مدت به عنوان گروه کنترل. سپس هر گروه توسط واکنش زنجیره­­ای پلیمراز(RT- PCR) به منظور بیان ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک ( NGF، BDNF، NT3، NT4/5و GDNF) و ژن­های نورونی (Nestin،TH  وNurr1) ارزیابی شد. در این مطالعه، از ایمینوسیتوشیمی Nestin و βІІІ-tubulin  به منظور تعیین سلول­هایی که این نشانگر­ها را بیان می­کنند استفاده شد.

 

نتایج: پاساژ پنجم MSCs که از موش صحرایی بالغ استخراج شدند، بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) قادرند بطور خودبخودی به سلول­های شبه نوروسفری تمایز یابند و به نشانگر نستین پاسخ مثبت می­دهند. بعد از هفته دوم کشت، سلول­های شبه نورونی به نشانگر  βІІІ-tubulin واکنش مثبت نشان دادند. بررسی­های آماری نشان داده است که  MSCs در گروه آزمایشی افزایش معنی­داری از ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک  NGF و  GDNFو ژن­های نورونی  Nestinو Nurr1 را نسبت به گروه کنترل نشان دادند    .(p<0.05)  

 

نتیجه گیری:  در این مطالعه نشان داده شد که MSCs در کشت طولانی مدت، به طورخودبخودی به نوروسفر تمایز پیدا می­کنند بدون اینکه با فاکتور رشد یا القا­کننده خاص همراه شوند و قادرند ژن­های اختصاصی نورون­های دوپامینرژیک مانند  THو Nurr1را بیان کنند. مطالعات ما نشان می­دهد که  MSCsدر شرایط کشت طولانی مدت توانایی تمایز به سلول­های نورونی را به طور خودبخودی دارا هستند و پیشنهاد می­شود منبع سلولی مناسبی در درمان بیماری­های نورولوژیکی باشند.

 

فصل اول: مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته

 

مقدمه:

 

امروزه تحقیق بر روی سلول­های بنیادی به دانش پیشرفته­ای تبدیل شده است که نه تنها در حیات علمی، بلکه در بعد اقتصادی نیز موثر قلمداد می­شود ]1[. سال­هاست که این تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسیم سلولی آیا می­توان درمان را بر پایه این سلول­ها بنا نهاد. این تفکر و تحقیق به تدریج به طرف طب جدیدی سوق داده می­شود که از آن به عنوان reparative (regenerative) medicine نام برده می­شود] 2[. پر واضح است برای رسیدن به این هدف، درک کامل بیولوژی سلولی و ماهیت سلول­های بنیادی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. خصوصا” علی­رغم تحقیقات وسیع، هنوز ابهامات متعددی پیرامون نحوه عملکرد سلول­های بنیادی وجود دارد ]3[.

 

سلول­های بنیادی، سلول­های زایای غیر بالغ­اند که قادر به خود تکثیری (Self-renewal) هستند و از این طریق جمعیت سلولی خود را حفظ می­کنند]4[. هر سلول بنیادی در کنام یا نیچ تنظیمی خود قرار گرفته است. کنام یک سلول، مجموعه­ای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلول­های بنیادی، تنظیم توازن بین خود نوزایی و تمایز است. یکی از مکانیسم­های تنظیم کننده این توازن کنترل تقسیم متقارن و نامتقارن می­باشد. در تقسیم نامتقارن، از تقسیم سلول ­بنیادی دو سلول دختری ایجاد می­گردد که یکی در کنام باقی مانده و دیگری کنام را ترک کرده تا تعداد زیادی پیش­ ساز ایجاد نماید و در نهایت به سلول­های بالغ تمایز پیدا می­کنند. در عوض در تقسیم متقارن، دو سلول­دختری ایجاد می­گردد که هر دو در کنام باقی مانده و به صورت بنیادی باقی می­مانند] 5، 6[. بنابراین سلول­های بنیادی، سلول­های تمایز نیافته­ای می­باشند که توانایی خود تکثیری، تولید نسل تمایز یافته عملکردی و ترمیم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[.

 

سلول­های بنیادی بر اساس قابلیت تمایز به سه گروه تقسیم می­شوند:

 

همه توان: جزء اولین سلول­هایی هستند که در جنین شکل می­گیرند ( از تخمک لقاح یافته 1-3 روزه)،  قابلیت تمایز به انواع سلول­های ارگانیسم را دارند] 4[.

 

پر توان: از توده سلولی داخلی در مرحله بلاستوسیست 100تا 200 سلولی منشاء می­گیرند. این سلول­ها دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند]7[.

 

چند توان: این گروه را سلول­های بنیادی بالغ و یا سلول­های بنیادی سوماتیك نیز می‌نامند که بصورت خاموش و غیر متعهد حفظ می­شوند تا در آینده و بر اساس نیاز فعال شده و به سایر دودمان­های مربوط به همان بافت تمایز یابند]8[، به عنوان مثال سلول­های بنیادی خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلول­های خونی مانند گلبول‌های قرمز، لنفوسیت‌های B وT  و … تمایز می‌یابند [9،10[.

 

سلول­های بنیادی از لحاظ منشاٴ به دو دسته­ی، سلول­های بنیادی جنینی (ESCs) و سلول­های بنیادی بالغ تقسیم می­شوند. از آنجا که استفاده از سلول­های بنیادی جنینی با مسائل اخلاقی و قانونی بسیار مواجه است و یا پیوند این سلول­ها خطر ایجاد بافت توموری را در پی خواهد داشت ]7،11[، بنابراین کلید حل این مشکل به دست آوردن منبع عظیمی از سلو­ل­هاست به گونه­ای­که قابلیت تمایز بالایی داشته باشد و قادر باشند به دفعات نامحدودی در محیط کشت تکثیر شوند تا تعداد کافی سلول قابل دسترس برای پیوند و یا هر کاربرد درمانی و پژوهشی فراهم آورد]4[.

 

سلول­های بنیادی مزانشیمی از مهم­ترین سلول­های بنیادی بالغ است. این سلول­ها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein  و Petrokova در سال 1966 استخراج شدند ]12[. سلول­های بنیادی مزانشیمی توان تمایز به چندین دودمان سلولی ازجمله استخوان، عصب، غضروف و كبد را دارند] 13 .[این سلول­ها به عنوان یك منبع ایده­آل برای سلول درمانی، ژن درمانی و به عنوان ابزاری برای درمان بیماری­های مادرزادی محسوب می­گردند] 14[. گزارش­هایی مبنی بر استفاده از این سلول­ها در مدل­های حیوانی برای درمان جراحات نخاعی] 15،16[، سكتة مغزی ]17 [و پاركینسون] 18 [وجود دارد.

 

1-1- سلول­های بنیادی جنینی

 

اولین تحقیقات در زمینه  ESCs در دهه 1960 شروع شد، هنگامیکه Finch و   Ephrussii درسال1960 ، سلول­های سرطانی جنینی چند توان را از سلول­های زایای سرطانی تمایز نیافته انسان و موش جدا کردند] 19.[

 

این سلول­ها اولین بار در سال1981 از توده سلولی داخلی جنین موش جدا سازی شدند، سپس در سال 1998، سلول­های بنیادی جنینی انسان استخراج شدند] 20،10.[ سلول­های بنیادی جنینی فعالیت تلومرازی شدیدی دارند و قادرند به طور نامحدودی تقسیم شوند، به گونه‌ای كه سلول­های بنیادی جنینی انسانی را می‌توان در شرایط محیط كشت تا بیش از یكسال به صورت تمایز نیافته حفظ كرد و جمعیت آنرا به 80 برابر رساند] 10.[  حضور آلکالین فسفاتاز و تلومراز و بیان نشانگر اختصاصی SSEA-1 از ویژگی­های اختصاصی سلول­های بنیادی جنینی می­باشد] 21.[

 

 

1-4-2  انتقال مکانیکی…………………………………………………………………………. 19

 

1-4-3 انتقال از راه خون……………………………………………………………………….. 19

 

1-4-4 انتقال مستقیم…………………………………………………………………………… 19

 

1-5 بیماری­زایی لیشمانیا…………………………………………………………………………. 20

 

1-5-1 خصوصیات بیماری لیشمانیا………………………………………………………….. 19

 

1-5-2 لیشمانیوز احشایی……………………………………………………………………….. 20

 

1-5-3  لیشمانیوز جلدی پس از کالاآزار (PKDL)…………………………………………….. 21

 

1-5-3-1 لیشمانیوز جلدی و اشکال بالینی آن………………………………………………… 22

 

1-5-3-2  لیشمانیوز جلدی خشک…………………………………………………………….. 22

 

1-5-3-3 لیشمانیوز جلدی مرطوب…………………………………………………………….. 22

 

1-5-3-4 لیشمانیوز جلدی مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas)………………….. 23

 

1-5-3-4-1 شکل لوپوئید یا عود کننده سالک (Lupoid or Recidivan form)………………. 24

 

1-5-3-5  لیشمانیوز جلدی- مخاطی……………………………………………………………. 24

 

1-6 ایمنولوژی عفونت­های لیشمانیا……………………………………………………………… 25

 

1-6-1  مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز پوستی………………………………………… 25

 

1-6-1-1 نقش آنتی بادی یا ایمنی همورال…………………………………………………….. 25

 

1-6-1-2 نقش ایمنی سلولی در لیشمانیوز جلدی…………………………………………… 26

 

1-6-1-3 عمل سلولهای نوتروفیل و ماكروفاژ در لیشمانیوز………………………………….. 26

 

1-6-1-3  عملکرد T-CELL……………………………………………………………………….

 

1-6-2  مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز احشایی………………………………………. 28

 

1-6-2-1 نقش ایمنی همورال در كالاآزار…………………………………………………………. 28

 

1-6-2-3 نقش ایمنی سلولی در كالاآزار………………………………………………………… 28

 

1-6-2-4 .نقش مهم سلول های CD⁺4……………………………………………………..

 

1-7  روشهای تشخیص و مطالعه لیشمانیوز…………………………………………………. 30

 

1-7-1 روشهای مستقیم تشخیص انگل………………………………………………………. 30

 

1-7-1-1 . جداسازی انگل از کناره ضایعات پوستی یا بافتهای آلوده…………………………. 31

 

1-7-1-1 رنگ آمیزی……………………………………………………………………………….. 31

 

1-7-1-2 کشت انگل……………………………………………………………………………….. 32

 

1-7-2  روشهای ایمنولوژی در شناسایی انگل…………………………………………………. 32

 

1-7-2-1 آزمایشات سرولوژی برای بررسی ایمنی همورال…………………………………… 32

 

1-7-2-2 آزمایشات ایمنولوژیکی جهت بررسی ایمنی سلولی……………………………… 33

 

1-7-2-2-1 تستهای پوستی……………………………………………………………………… 33

 

1-7-2-3 ماهیت پاسخهای ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH)…………………………………… 34

 

1-7-3 آزمون پوستی لیشمانین یا تست مونتنگرو……………………………………………….. 35

 

1-7-3-1 معرف آنتی­ژنی لیشمانین برای تست پوستی………………………………………… 35

 

1-7-4 تست سنجش تکثیر لنفوسیتی  ymphocyte proliferation test(L.T.T) …………….

 

فصل دوم : مروری بر متون گذشته

 

فصل سوم: مواد و روشها

 

3-1کشت انگل………………………………………………………………………………………. 43

 

3 -1-1  مواد مورد نیاز جهت كشت انگل………………………………………………………….. 43

 

 

3-1-2. وسایل مورد نیاز جهت كشت انگل……………………………………………………….. 43

 

3-1-3. طرز تهیه محیط كشت مایع RPMI- 1640‌…………………………………………………

 

3-1-4. طرز تهیه محیط كشت كامل………………………………………………………………….. 44

 

3-1-5. طرز تهیه محیط كشت NNN……………………………………………………………….

 

3-1-6. طرز تهیه (PBS) Phosphate Buffered Saline…………………………………………..

 

3-1-7. روش كشت انگل……………………………………………………………………………. 45

 

3-1-8. روش شمارش سلولها………………………………………………………………………. 46

 

3-1-8-1. مواد و وسایل لازم جهت شمارش انگل………………………………………………… 46

 

3-1-8-2. شمارش با لام نئوبار……………………………………………………………………… 46

 

3-2. جداسازی انگلها با limiting dilution assay……………………………………………….

 

3-2-1. مواد و وسایل مورد نیاز برای Limiting dilution assay……………………………….

 

3-2-2. مراحل Limiting dilution assay…………………………………………………………

 

3-3. تهیه کرایو برای ذخیره در بانک سلولی…………………………………………………….. 50

 

3-3-1. مواد و وسایل لازم جهت تهیه کرایو……………………………………………………… 50

 

3-4 تهیه آنتی­ژن Freeze – thaw از انگلها جهت درهم ریختگی غشاء و بروز تمامی آنتی­ژن­ها…. 52

 

3-5 الکتروفورز آنتی­ژن­های پروتئینی در ژل پلی­آکریل­آمید ( SDS-PAGE )……………………….. 53

 

3-5-1 اصول الکتروفورز در ژل پلی­آکریل­آمید……………………………………………………….. 53

 

3-5-2 سیستم بافری………………………………………………………………………………. 54

 

3-5-3  مواد و وسایل مورد نیاز برای SDS-PAGE………………………………………………..

 

3-5-4 آماده­سازی نمونه………………………………………………………………………….. 57

 

3-5-6 طرز تهیه بافر الکترود…………………………………………………………………………. 57

 

3-5-7. روش انجام SDS-PAGE…………………………………………………………………….

 

3-5-8 روش رنگ­آمیزی با کوماسی آبی R- 250…………………………………………………

 

مواد مورد نیاز رنگ­آمیزی کوماسی آبی R- 250:………………………………………………..

 

3-6 سنجش میزان پروتئین تام با Bradford assay…………………………………………..

 

3-6-1 مواد و معرف­های مورد نیاز تست Bradford……………………………………………..

 

3-6- 2 روش کار سنجش پروتئین تام……………………………………………………………. 61

 

3-7 تست Lymphocyte transformation test (L.T.T)………………………………………..

 

3-7-1 روش انجام تست L.T.T………………………………………………………………….

 

1-3-7-1. مواد و وسایل لازم جهت انجام تست L.T.T………………………………………..

 

3-8 ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………………………………………. 66

 

3-8-1 مواد و وسایل مورد نیاز ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………….. 67

 

3-8-2  نحوه ایمنی­زایی در خوکچه………………………………………………………………… 67

 

3-9 تزریق داخل پوستی آنتی­ژن­ها و سنجش میزانDTH…………………………………..

 

3-9-1 مواد و وسایل لازم برای تزریق داخل پوستی و سنجش میزان DTH…………….

 

3-9-2  مراحل تزریق داخل پوستی………………………………………………………………. 69

 

3-9-3  نحوه سنجش میزان DTH………………………………………………………….

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1 کشت اولیه و جداسازی تک کلون­ها با روش limiting dilution………………………

 

4-2  بررسی پروفایل پروتئینی در آنالیز تک کلون­ها…………………………………………… 72

 

4-3 نتایج میزان پروتئین تام آنتی­ژن­ها به روش Bradford………………………………..

 

4-4 بررسی نتایج تست L.T.T………………………………………………………………

 

4-4-1  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن B…………………………………………….

 

4-4-2  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن C…………………………………………….

 

4-4-3.  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن D…………………………………………….

 

4-4-4 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن لیشمانین استاندارد (M)……………………… 76

 

4-4-5.  بررسی نتایج حاصل  از اندکس تحریکی تمامی آنتی­ژن­ها و میانگین آنها در مقایسه با Con-A

 

4-4-6 بررسی نتایج کلی L.T.T…………………………………………………………….

 

4-5 بررسی نتایج تست­های DTH بر روی خوکچه­های هندی………………………………. 79

 

4-5-1  نتایج تست DTH 24 ساعته………………………………………………………… 79

 

4-5-2 نتایج تست DTH 48 ساعته……………………………………………………………. 82

 

4-5-3 نتایج تست DTH 72 ساعته………………………………………………………… 83

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

 

منابع……………………………………………………………………………………………… 95

 

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………….. 106

 

خلاصه فارسی:

 

مقدمه: لیشمانیا ماژور یک انگل پاتوژن پروتوزوأ داخل سلولی است که عامل طیف وسیعی از عفونت­های پوستی با پیامدهای بالینی متنوع، از یک زخم پوستی خود بهبود شونده تا زخم­های گسترش یافته غیر بهبود شونده می­باشد. ایمنی سلولی نقش مهمی در مقاومت در برابر لیشمانیا ماژور بازی می­کند. واکنش­های حساسیت شدید دیررس که با تست­های پوستی لیشمانین تشخیص داده می­شوند یک روش تشخیصی برای سنجش ایمنی سلولی است و بطور وسیع برای سنجش اپیدمیولوژیکی افراد در معرض آنتی­ژن­های لیشمانیایی، سنجش واکسن­های کاندید و در کمک به تشخیص، مورد استفاده است. تست پوستی لیشمانین پبطور عمومی به نام تست مونتنگرو یا تست لیشمانین شناخته می­شود، که نیازمند یک آنتی­ژن استاندارد خالص و هموژن می­باشد.

 

هدف: تهیه و سنجش تک­کلون­های جداشده از لیشمانیا ماژور برای تست­ پوستی

 

روش: جداسازی تک­کلون­ها از سوش لیشمانیا ماژور مرجع (MRHO/IR/75/ER) به روش رقت دهی محدود شونده انجام گرفت. کلون­های جداشده با استفاده از روش­های برون­تنی، SDS-PAGE و تست تکثیر لنفوسیتی با استفاده از سلول­های تک­هسته­ای خون محیطی افراد  بهبود یافته از عفونت لیشمانیا ماژور مورد ارزیابی قرار گرفتند. توانایی هر تک­کلون جداشده با تست پوستی چهار خوکچه هندی ایمن شده دربرابر لیشمانیا ماژور مورد سنجش قرار گرفته شدند. تک­ کلون­ های جداشده به­همراه لیشمانین در ناحیه اصلاح شده شکمی حیوان­ها بطور داخل پوستی تزریق شدند.

 

نتایج: نتایج نشان دادند که سه نمونه از هفت تک­کلون­ ( نمونه D و(B,C در آنالیزهای SDS-PAGE یک تک باند را نشان دادند. این تک­کلون­ها برای سنجش در تست تکثیر لنفوسیتی مورد استفاده قرار گرفتند که همگی میزان ضریب تحریک (03/2±71/8، 65/2±71/8، 13/2±43/8 به ترتیب) قابل مقایسه­ای با لیشمانین ( 512/3±10) نشان دادند. سنجش درون­تنی تک­کلون­های جداشده، در خوکچه­های هندی نشان داد که هر سه تک­کلون میزان القاء قابل قبولی در مقایسه با لیشمانین از خود نشان دادند. بعلاوه، کلون C (83/0±333/7) میزان القاء معنادار بیشتری از لیشمانین ( mm00/4) در خوکچه­های هندی تست شده با آنتی­ژن C نشان داد.

 

یافته ­ها: اطلاعات نشان دادند که تک­ کلون­های جداشده توانایی القاء واکنش­های درون­تنی و برون­تنی قابل مقایسه­ای با لیشمانین استاندارد دارند و امکان استفاده جهت آنتی­ژن خالص و هموژن را در تست­های پوستی در مطالعات لیشمانیوزی را دارند

 

مقدمه:

 

انگل لیشمانیا یک پروتوزوای جنس لیشمانیا یک پاتوژن داخل سلولی است که می تواند باعث ایجاد طیف وسیعی از بیماری های انسانی از یک زخم پوستی ساده تا عفونت های احشایی شود که با گزش پشه خاکی آلوده به میزبان پستاندار از جمله انسان منتقل می­شود(99).

 

به بیماری­های حاصل از انگل های جنس لیشمانیا، لیشمانیازیس گفته می­شود. این بیماری در 88 کشور در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری جهان گسترش یافته است و اینک 12 میلیون نفر به این انگل مبتلا می باشند و350 میلیون نفر در خطر ابتلا به این بیماری قرار دارند. با وجود کوشش هایی که برای مبارزه با بیماری انجام شده، سالیانه 1 تا 2 میلیون مورد جدید جهانی گزارش می شود ، که 5/1 میلیون مورد از نوع جلدی و500هزار نفر از انواع احشایی می­باشد. در انسان بیماری به سه فرم بالینی جلدی (CL)[1]، جلدی مخاطی (ML)[2] و احشایی (VL)[3] بروز می­کند(57،83).

 

عفونتهای پارازیتی مثل لیشمانیوز می توانند در  بیماریهای ایمنوساپرس کننده مثلHIV پدیدار شود. عفونت توأم این بیماری­ها با لیشمانیوز بعنوان یک تهدید جدی در کشورهایی است که هر دو عامل پاتوژنیک را دارند( 106).

 

سازمان بهداشت جهانی آن را  در زمره 8 بیماری مهم انگلی دنیا با شیوع بالا در جهان قرار داده است. کنترل این بیماری از اولویتهای سیستم بهداشتی و درمانی جهان است و نیز از اولویتهای تحقیقاتی انیستیتو پاستور ایران نیز می­باشد(49).

 

افراد در تمام سنین در معرض ابتلا به این بیماری می باشند. بیش از %90 موارد ابتلا به لیشمانیای پوستی در کشورهای افغانستان، عراق، پرو، عربستان سعودی و متأسفانه ایران گزارش شده است( 47). این انگل امروزه بصورت انگلی فرصت طلب در افراد دچار نقص ایمنی درآمده است و به دلیل اینکه در ایران نیز موارد ابتلا به آن زیاد می باشد، لذا لازم است در زمینه شناخت بیشتر خود انگل و راه­های مقابله با آن مطالعات وسیعتری صورت گیرد.

 

فصل اول: کلیات

 

تعریف بیماری لیشمانیوز:

 

انگل پروتوزوای جنس لیشمانیا  یک پاتوژن داخل سلولی است که می تواند باعث بروز طیف وسیعی از بیماری های انسانی از یک زخم پوستی تا عفونت های احشایی شود. این انگل­ها با گزش پشه خاکی آلوده به میزبان پستاندار از جمله انسان منتقل می­شود( 47). این بیماری در نواحی روستایی و شهری بیشتر نقاط کشور وجود دارد. ناقل بیماری تنها یک سوم اندازه پشه معمولی است و به سختی با چشم دیده می شود. انسان در نوع شهری لیشمانیوز (سالک شهری) به عنوان میزبان اصلی محسوب می شود و به ندرت اتفاق می افتد که از مادر باردار به جنین یا با انتقال خون یا سوزن آلوده سرایت کند( 47).

 

این بیماری در انسان می تواند به اشکال مختلف بروز نماید و در مورد فرم احشایی در صورت عدم درمان حتی به مرگ منجر گردد(29،17). ژنوم این انگل در سال 2002 حدود 32 مگا باز ژنوم و8500 ژن تخمین زده شد که با ترجمه آنها بیشتر از 10000 پروتئین حاصل خواهد شد(16).

 

یکی از خصوصیات مهم انگل لیشمانیا، رشد و تکثیرآن در درون فاگولیزوزوم­های ماکروفاژها است. تعداد کمی از میکروارگانسیم ها قادرند که تحت چنین شرایطی ودر مجاورت انواع آنزیم های هیدرولیتیک زندگی کنند. بنابراین مراحلی که منجر به ورود انگل به درون فاگولیزوزوم می­گردد از اهمیت خاصی برخوردار است(77).

 

میزبان مهره دار برای انگل شامل میزبان پستاندار وخزنده است که میزبان پستاندار شامل انسان، سگ، سگ سانان و برخی جوندگان ودیگر جانوران وحشی می باشد. لیشمانیوزها عموما توسط گونه های پشه خاکی منتقل می شوند. ناقل این انگل ها در دنیای قدیم (همه قاره ها بجز آمریکا) پشه خاکی های متعلق به جنس فلوبوتوموس می باشد و در دنیای جدید گونه های مختلف پشه خاکی های ماده از جنس لوتزومیا
می­باشد(20،92،69،101).

 

عامل بیماری­زایی در لیشمانیوز، یعنی لیشمانیا، از راسته کینتوپلاست داران است که برحسب سیر تکاملی و محیط زیست خود به دو شکل بی تاژک یا آماستیگوت (یا جسم لیشمن) در درون سلولهای سیستم رتیکولواندوتلیال مهره داران مانند ماکروفاژها و شکل تاژکدار پروماستیگوت (یا لیپومونادی) در درون بدن پشه خاکی ناقل و محیط کشتهای مصنوعی مثل NNN[1] دیده می­شود (3).

 

2-1-1- تاریخچه لیشمانیوز در جهان

 

کانینگهام[1] در سال 1885 در فرانسه ترشحات زخم پوستی بیماری را که به آن تاول دهلی می گفتند، مورد مطالعه قرار دارد. این محقق، ماکروفاژهای میزبان را انگل آمیبی پنداشته و اجسام داخل ماکروفاژها را هاگ (اسپور) تصور کرده بود(64). رایت اجسامی شبیه به آنچه کانینگهام گزارش داده بود در زخم پوستی دختری که از ارمنستان به بوستون مهاجرت کرده بود مشاهده کرد. او این انگل را هلیکوزوماتروپیکوم نامید و فکر می کرد که متعلق به گروه میکروسپوریدیا باشد(3و18). در سال 1900 لیشمان[2] در طحال سربازی که از تب دام دام[3] در هندوستان مرده بود اجسام بیضی شکلی را در داخل سلول های بزرگی مشاهده کرد (دام دام شهری است که بیماری لیشمانیوزاحشائی در آن دیده شده بود). لیشمان نتیجه مطالعات خود را در سال1903 منتشر ساخت.

 

 

1-5-3-  فیزیولوژی اکتینومیست‌ها………………………………… 17

 

1-5-4- اکولوژی اکتینومیست‌ها…………………………………… 18

 

1-5- 5- طبقه بندی اکتینومیست‌ها ………………………………19

 

1-5-6- متابولیت‌های ثانویه……………………………………….. 20

 

1-5- 7- اکتینومیست‌های تولید کننده ترکیبات فعال…………… 21

 

1-5-8- تنوع شیمیایی ترکیبات تولید شده توسط اکتینومیست…..23

 

1-5-8-  اهمیت استرپتومیسس‌ها………………………………. 24

 

1-5-9-  اکتینومیست‌های دریایی……………………………….. 25

 

1-5-10-متابولیت‌های ضد قارچی و اهمیت اکتینومیست‌های دریایی….27

 

1-5- 11- اکتینومیست‌های دریایی، منبعی برای کشف داروی جدید……28

 

1-6- اهداف پژوهش………………………………………………….29

 

2- مواد و روش‌ها……………………………………………………. 32

 

2-1- دستگاه‌ها و تجهیزات………………………………………….32

 

2-2- محلول‎ها و مواد مورد نیاز ……………………………………33

 

2-3- جمع‌آوری نمونه………………………………………………. 36

 

2-4- غنی‌سازی و کشت اکتینومیست‌ها………………………..37

 

2-5- جداسازی و تهیه کشت خالص اکتینومیست‌ها…………….38

 

2-6- حفظ و نگهداری ذخایر کشت باکتریایی……………………..38

 

2-6-1- نگهداری کوتاه‌مدت………………………………………… 38

 

2-6-2- روش نگهداری بلند مدت…………………………………… 38

 

2-7- شناسایی باکتری‌ها ………………………………………….39

 

2-7-1- بررسی مورفولوژی………………………………………….39

 

2-7-2- بررسی مورفولوژی باکتریایی و رنگ‌آمیزی گرم…………..39

 

2-7-3-تولید پیگمان محلول………………………………………….40

 

2-8-غربالگری اولیه اکتینومیست های دارای فعالیت ضد باکتریایی….40

 

2-9- استخراج عصاره خام جدایه‌های فعال اکتینومیست……….41

 

2-10-غربالگری ثانویه برای یافتن متابولیت‌های ضد میکروبی…..41

 

2-10-1-بررسی فعالیت ضد باکتریایی سویه‌های فعال…………..41

 

2-10-2-بررسی فعالیت ضد قارچی سویه‌های فعال……………. 42

 

2-10-3-فعالیت سینرژیسمی عصاره خام اکتینومیست‌ها با آنتی بیوتیک…..43

 

2-10-4- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین….43

 

2-12-بررسی فعالیت اگزوآنزیمی سویه‌های فعال ……………….44

 

2-13- استخراج  نوکلئیک اسید به روش بیدبیتر ………………..44

 

2-14- الکتروفورز با ژل آگارز 8/0 درصد……………………………..45

 

2-15- تکثیر ژن rDNA 16S …………………………………………

 

2-15-1- برنامه PCR برای ژن‌های 16S rDNA:……………………

 

2-16- تخلیص محصول PCR………………………………………..

 

2-17- بررسی مولکولی ژن 16S rDNA…………………………..

 

2-17-1- تعیین توالی ژن 16S rDNA:……………………………..

 

2-17-2- انجام BLAST………………………………………………

 

 

2-17-3- رسم درخت فیلوژنی ژن 16S rDNA……………………

 

3- نتایج………………………………………………………………. 50

 

3-1- جداسازی اکتینومیست‌ها……………………………………. 50

 

3-2- غربالگری اولیه جهت شناخت جدایه‌های فعال…………….. 52

 

3-3- غربالگری ثانویه جدایه‌های فعال علیه باکتری‌های بیماریزا….55

 

3-4- بررسی فعالیت ضد قارچی جدایه‌های فعال…………………..56

 

3-5- فعالیت سینرژیسمی عصاره خام اکتینومیست‌ها با آنتی بیوتیک….58

 

3-6- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA)….59

 

3-7- فعالیت آنزیمی جدایه‌ها……………………………………….. 61

 

3-8- مورفولوژی اسپور کلنی و رنگ آمیزی جدایه‌ها……………… 61

 

3-9-تولید پیگمان محلول……………………………………………….65

 

3-10- استخراج نوکلئیک اسید و آنالیز آن با الکتروفورز……………..66

 

3-11- تکثیر ژن 16s rDNA جدایه‌های فعال…………………………..67

 

3-11-1- شناسایی مولکولی جدایه‌ها و رسم درخت فیلوژنی ژن 16S rDNA

 

4- بحث و پیشنهادات………………………………………………….. 73

 

4-1- جداسازی اکتینومیست‌های دریایی………………………….. 75

 

4-2- غربالگری سویه‌های اکتینومیست فعال……………………….. 75

 

4-3- استخراج متابولیت‌ها…………………………………………….. 76

 

4-4-غربالگری ثانویه عصاره خام جدایه‌های فعال…………………….. 76

 

4-5- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین…77

 

4-6- مورفولوژی کلنی‌ها………………………………………………. 78

 

4-7- بررسی توالی‌ 16S rDNA………………………………………..

 

4-8- جمع بندی ………………………………………………………… 79

 

4-9-پیشنهادات …………………………………………………………..81

 

چکیده:

 

اکتینومیست‌ها همواره به عنوان یک منبع اصلی تولید کننده آنتی‌بیوتیک‌های جدید و متابولیت‌های ثانویه متنوع، در داروسازی مورد توجه بوده‌ است. هدف از این تحقیق جداسازی اکتینومیست‌های تولیدکننده متابولیت‌های فعال از رسوبات بستر دریای مازندران و بررسی پتانسیل تولید متابولیت‌های ضدباکتریایی، ضد قارچی و آنزیمی توسط این ارگانیسم‌ها می‌باشد. رسوبات دریای مازندران از اعماق 5 و 10 متر جمع‌آوری شد. نمونه‌ها رقیق شده و برای جداسازی اکتینومیست‌ها در محیط کشت انتخابی استارچ کازئین آگار (SCA) کشت داده شد. جدایه‌ها توسط روش‌های مورفولوژی و میکروسکوپی کلنی‌ها، شناسایی و جداسازی شدند. غربالگری اولیه جهت یافتن جدایه‌های فعال با روش Cross streak انجام شد. متابولیت‌های تولید شده توسط جدایه‌های فعال، استخراج شد و بررسی فعالیت این عصاره خام علیه باکتری‌ها و قارچ‌های بیماریزا و باکتری‌های مقاوم به آنتی بیوتیک با استفاده از روش انتشار در دیسک بررسی شد. از رسوبات دریا، تعداد 80 جدایه اکتینومیست جداسازی و شناسایی شد. در غربالگری اولیه 7 جدایه دارای بهترین فعالیت ضدباکتریایی به عنوان اکتینومیست‌ فعال بررسی شدند. نتایج مرحله دوم غربالگری نشان داد که جدایه‌های فعال جداشده، فعالیت ضد قارچی خوب علیه گونه‌های کاندیدا و آسپرژیلوس داشتند. نتایج نشان داد که جدایه‌های MN39، MN2 و MN3 فعالیت ضد قارچی بیشتری نسبت به بقیه جدایه‌ها نشان دادند. همچنین سویه‌های MN2(16±1.4) و (18±1.4) MN39 دارای فعالیت بهتری نسبت به آنتی‌بیوتیک وانکومایسین (14±1.4) علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) نشان دادند. بررسی توالی ژن 16S rDNA سویه‌های فعال و رسم درخت فیلوژنی آن‌ها نشان داد که 7 جدایه فعال متعلق به جنسsp. Streptomyces می‌باشند. در این تحقیق به منظور بررسی فعالیت ضد میکروبی میکروارگانیسم‌های بومی ایران، برای اولین‌ بار از رسوبات بستر دریای مازندران، اکتینومیست‌ها جداسازی و مطالعه شدند. نتایج نشان داد که رسوبات بستر دریای مازندران می‌تواند به ‌عنوان منبع غنی از اکتینومیست‌های فعال که توانایی تولید متابولیت‌های ضد میکروبی جدید را دارند، مورد مطالعه دقیق‌تری قرار گیرد. بنابراین با  خالص‌سازی و مطالعه دقیق‌تر متابولیت‌های فعال اکتینومیست‌های رسوبات بستر دریای مازندران، بتوان آنتی‌بیوتیک‌های جدید و مناسب برای درمان بیماری‌های عفونی ناشی از میکروارگانیسم‌های مقاوم، معرفی کرد.

 

فصل اول: مقدمه

 

1- مقدمه

 

1-1- تاریخچه آنتی بیوتیک

 

مدت‌ها قبل از کشف پنی‌سیلین بشر آموخته بود به‌طور تجربی بعضی مواد خام را به عنوان عامل ضد میکروب مورد استفاده قرار دهد. ۶۰۰ – ۵۰۰ سال قبل از میلاد، چینی‌ها شیره کپک زده لوبیای شور را برای درمان عفونت‌ها بکار می‌بردند. در گذشته از عصاره گیاهانی مثل درمنه برای مقابله با کرم آسکاریس، از پوست درخت سینچونا[2] برای درمان مالاریا و از ریشه گیاه اپیکا در درمان اسهال استفاده می‌کردند اما مصرف دوز بیش از حد آنها عوارضی همچون سمیت، اختلالات شنوایی و بینایی داشت. از فلزات سنگین نیز در درمان بیماری‌ها استفاده می‌شد. از جیوه در درمان سفلیس و آرسنیک در درمان بیماری انگل تریپانوزوما استفاده می‌شد که به‌دلیل سمیت بالای این ترکیبات درمان را با مشکل مواجه می‌کرد. در سال 1910 پائول ارلیخ ترکیبات شیمیایی مختلف را به عنوان مواد ضد میکروبی آزمایش کرد و پایه گذار شیمی درمانی مدرن بود. او ارسفانآمین[4] را به عنوان اولین داروی موثر برای سفلیس معرفی کرد. کلمه آنتی بیوتیک از اصطلاح آنتی بیوز اولین بار در سال ۱۸۸۹ به‌وسیله ویلمین[6] برای توجیه ماهیت رقابتی جوامع بیولوژیک که در آن فقط قویترین و اصلح‌ترین زنده می‌ماند بکار برده شد و چند سال بعد این اصطلاح برای آنتاگونیسم[7] میکروارگانیسم‌ها نیز مورد استفاده قرار گرفت.

 

 آنتی بیوتیک‌ها مواد شیمیایی هستند که از میکروارگانیسم‌هایی مانند قارچ‌های میکروسکوپی و باکتری‌ها گرفته می‌شوند و از ادامه زندگی سلول‌های یوکاریوتی یا پروکاریوتی جلوگیری نموده و یا مانع تکثیر آنها می‌شوند در قرن 19 آقای لوئی پاستور و رابرت کخ باکتری‌ها را به عنوان عوامل بیماری معرفی کردند و کنترل آنهارا امری ضروری دانستند. تا قرن بیستم، داروهای نسبتا اندکی وجود داشت. در سال‌های اول قرن بیستم، پژوهشگران امور پزشکی امیدوار بودند که بتوانند با کشف یا ساخت داروهای جدید عامل عفونت را در داخل بدن از بین ببرند.

 

اولین کشف مهم در این زمینه بوسیله پزشک اسکاتلندی، الکساندر فلمینک در سال 1928 میلادی انجام گرفت. در تابستان سال 1928 فلمینگ مشغول تحقیق درباره آنفلوانزا بود. ضمن انجام كارهای معمول آزمایشگاهی كه می‌بایست كشت‌های باكتریایی را كه در ظرف‌های پهن در پوش‌دار رشد كرده بودند زیر میكروسكوپ بررسی كند، متوجه شد كه در یكی از ظرف‌ها ناحیه شفافی به وجود آمده است. تحقیقات بیشتر نشان داد كه ناحیه شفاف در اطراف نقطه‌ای بود كه وقتی سرپوش ظرف گذاشته نشده بود، تكه‌ای كپك به درون آن افتاده بود. فلمینگ با به خاطر آوردن تجربیاتش در زمینه لیزوزیم، نتیجه گرفت كه كپك چیزی تولید می‌كند كه باعث مرگ باكتری‌های استافیلوكوكوس در ظرف كشت شده بود. فلمینگ كپك را جدا كرد و آن را به عنوان یكی از اعضای جنس پنی‌سیلیوم شناخت، و ماده آنتی بیوتیكی را كه تولید می‌كرد پنی‌سیلین نامید. فلمینگ در ادامه نشان داد كه پنی‌سیلین برای جانوران سمی نیست و به یاخته‌های بدن آسیبی نمی‌رساند. به سبب ضرورت بهره‌گیری سریع از توانایی پنی‌سیلین در مقابله با بیماری‌ها و درمان زخم‌های نظامیان جنگ جهانی دوم، تولید آن در مقیاس گسترده، هم در انگلستان و هم در ایالات متحده، از اولویت‌های اول بود. استفاده از پنی‌سیلین نه تنها جان هزاران نفر را طی جنگ جهانی نجات داد، بلكه عاملی شد تا برای كشف آنتی بیوتیك‌های دیگر، از جمله خانواده‌ای از تركیبات مشابه شیمیایی پنی‌سیلین به نام سفالوسپورین‌ها، پژوهش‌هایی انجام گیرد.

 

 در سال 1945 جایزه نوبل در پزشكی به طور مشترك به او و فلوری[13] و چاین[14] داده شد (Clardy, 2009). با معرفی آنتی بیوتیک پنی‌سیلین به عنوان یک متابولیت ثانویه از کپک پنی‌سلیوم نوتاتوم[15] به دست آمد، دوران مدرن شیمی درمانی در سال 1940برای درمان بیماری‌های عفونی در انسان آغاز شد (Ligon, 2004). با کشف آنتی‌بیوتیک گرامایسیدین در سال 1939 به عنوان اولین عامل باکتری‌کش از یک باکتری جداشده شده از خاک (باسیلوس برویس[17]) نقطه آغاز جداسازی و غربالگری باکتری‌ها و قارچ‌های خاک برای دستیابی به آنتی بیوتیک‌های جدید آغازشد (Dubos, 1993) کشف آنتی‌بیوتیک استرپتومایسین در سال 1943 از باکتری استرپتومایسس، باکتری‌ها را درکانون توجه عموم برای کشف داروهای جدید قرار داد (Riedlinger, 2004).  استرپتومایسین اولین ترکیب از مجموعه متابولیت‌های ثانویه فعال زیستی بود که از اعضای جنس استرپتومایسس به دست ‌آمد و به عنوان آغاز مسیر تولید آنتی‌بیوتیک از سایر باکتری‌ها معرفی می‌شود (Berdy, 2005). در حالی که تعریف اصلی از آنتی بیوتیک‌ها  که توسط میکروبیولوژیست خاک واکسمن،کاشف استرپتومایسین، به شدت متکی بر متابولیت‌های مولکولی تولید شده توسط میکروارگانیسم‌هایی بود که باعث مهار رشد و یا از بین بردن میکروارگانیسم‌های دیگر می‌شد بود ولی امروزه این اصطلاح همچنین شامل عوامل به دست آمده از سایر منابع طبیعی و یا ترکیبات با منشاء نیمه سنتتیک یا مصنوعی نیز گفته می‌شود (Laskin, 2003).

 

1-1-1- مکانیسم عمل آنتی بیوتیک‌ها

 

بیشتر آنتی بیوتیک‌ها بر روی هر دو نوع سلول پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها اثر می‌گذارند و به همین دلیل نمی‌توان همه آنها را از نظر درمانی برای انسان مورد استفاده قرار داد. آنتی‌بیوتیک‌ها به دو گروه عمده‌ی عوامل کشنده یا سیدال که تمام سلول ها را می کشند و عوامل استاتیک که رشد باکتری را مهار می‌کنند طبقه بندی می‌شوند. در جدول شماره 1-1 مهمترین دارو‌های ضد میکروبی و مکانیسم اثر آن‌ها را نشان می‌دهد. آنتی بیوتیک‌ها از طریق چهار مکانیسم کلّی ویژگی باکتریوسیدی یا باکتریواستاتیکی خود را بروز می‌دهند.

 

1-1-1-1- جلوگیری از سنتز دیواره سلولی باکتری: باكتری‌ها یك لایه خارجی سخت دارند كه دیواره سلولی آنها است و شكل میكروارگانیسم را تعیین می‌كند و از سلول باكتری كه فشار اسموتیك بالایی دارد محافظت می‌نماید . آسیب به دیواره سلولی (توسط لیزوزیم) یا مهار تولید آن ، به متلاشی شدن سلول می‌انجامد. آنتی‌بیوتیک‌هایی که باعث مهار سنتز دیواره ی سلولی می شوند عبارتند از: پنی‌سیلین‌ها (پنی‌سیلین G، پنی سیلین V، آمپی سیلین، نفسیلین، تیکارسیلین،کاربنی‌سیلین، کلوکاسیلین)، سفالوسپورین‌ها، باسیتراسین، وانکومایسین، سیکلوسرین، نووبیوسین، تیکوپلانین، ریستوستین، فوزومیوسین و فسفونوپپتیدها.

 

2-1-1-1- مهار پروتئین سازی: آنتی بیوتیک‌های این گروه را می توان در دو گروه ممانعت کننده از نسخه برداری و ممانعت کننده از ترجمه تقسیم بندی کرد. گروه اول شامل اکتینومایسین که با اتصال به مولکول DNA مانع سنتز mRNA می شود و ریفامپین که با اتصال به آنزیم RNA پلی مراز مانع سنتز mRNA می‌شود. گروه دوم شامل آنتی‌بیوتیک‌های مهارکننده جزء30S ریبوزوم(آمینوگلیکوزیدها، آمینو سایکلیتول‌ها، تتراسایکلین ها) و آنتی بیوتیک‌های مهار کننده جزء 50Sریبوزوم(ماکرولیدها، لینکومایسین‌ها و تتراسایکلین).

 

3-1-1-1- جلوگیری از سنتز اسید نوکلئیک: این گروه شامل میتومایسن( به دو زنجیره مکمل DNA متصل شده و مانع جدا شدن و همانندسازی آن می‌شود)، اکتینومایسین ( به مولکول DNA متصل شده و مانع سنتز مولکول mRNA  می‌شود)، ریفامپین (به آنزیم RNA پلی مراز متصل شده و مانع سنتز mRNA می‌شود)، کینولون‌ها (نالیدیکسیک اسید؛ سینوکساسین و مشتقات فلورینه آن شامل نورفلوکساسین، سیپروفلوکساسین) می‌باشند.

 

4-1-1-1- تغییر در عملکرد غشاء سلولی: سیتوپلاسم تمام سلول‌های زنده توسط یك غشای سیتوپلاسمی محصور شده كه به‌عنوان یك غشای دارای نفوذپذیری انتخابی عمل می‌كند . این دسته با ایجاد تغییراتی در غشاء سلولی باعث افزایش نفوذپذیری و در نتیجه تخریب غشاء می‌شوند. نمونه این مكانیسم اثر پلی‌میكسین‌ها به طور مستقیم بر فسفاتیدیل اتانول آمین غشا در باكتری‌های گرم منفی می‌باشد و پلی ان‌ها که بر قارچ‌ها موثر هستند از دیگر داروهایی كه با مهار عمل غشای سلولی اثر می‌گذارند می‌توان به آمفوتریسین ب ، كلیستین، کلوتریمازول، کتوکونازول، ایمیدازول، تری آزول‌ها و یونوفورها اشاره كرد.

 

2-1-1- ژنتیک تولید آنتی بیوتیک

 

ژن تولیدکننده آنتی‌بیوتیک و دیگر متابولیت‌های ثانویه اکتینومیست‌ها معمولا به‌صورت کلاستر و یا به صورت پلاسمیدهای خطی بزرگ دیده می‌شوند. از نظر ژنتیکی آنتی بیوتیک‌ها با وزن مولکولی پائین، ساختار بسیار پیچیده دارند که نزدیک به 50 ژن در سنتز آنها دخالت دارد (Cundliffe, 2006). این در حالی است که یک ژن به آسانی می‌تواند یک پروتئین به وزن 100 کیلو دالتون را رمز گذاری کند(Challis, 2003). بعضی از جنس‌های استرپتومیسس بیش از 20 کلاستر ژنی را به سنتز متابولیت‌های ثانویه اختصاص داده‌اند. هر آنتی بیوتیک حدود 1% از کل ژنوم اکتینومیست تولید کننده را لازم دارد. علاوه بر ژن‌های لازم برای سنتز آنتی بیوتیک بعضی کلاستر‌ها دارای ژن‌های تنظیم کننده تولید آنتی بیوتیک می‌باشند (Cundliffe, 1989).

 

[1] . Clustered

 

[1] . Cidal