پایان نامه ارشد: بررسی تاثیر آلدوسترون در بهبود کیفی جنین های حاصل از تخمک های منجمد شده گوسفند |
1-5-4-کشت جنین در شرایط آزمایشگاهی(IVC)………………………………………………..23
1-6- مقایسه جنینهای طبیعی با جنینهای آزمایشگاهی……………………………………….26
1-7- انجماد
1-7-1- مراحل اصلی انجماد…………………………………………………………………………30
1-7-2- راههای کاهش اثرات زیانبار مواد محافظت کننده…………………………………………30
1-7-3- روشهای انجماد……………………………………………………………………………….30
1-7-3-1- انجماد شیشهای…………………………………………………………………………..31
1-7-3-1-1- عوامل تکنیکی موثر در انجماد شیشهای……………………………………………..32
1-7-3-1-1-1- زمان تعادل و آبگیری……………………………………………………………………32
1-7-3-1-1-2- سرعت سرد کردن………………………………………………………………………32
1-7-3-1-1-3- سرعت گرم کردن……………………………………………………………………….35
1-7-3-1-1-4- مواد محافظ انجمادی……………………………………………………………………35
1-7-3-1-1-5- نقش ضد یخها…………………………………………………………………………..36
1-7-3-1-1-6- ذوب و آبدهی…………………………………………………………………………. 36
1-8- آلدوسترون………………………………………………………………………………………….37
1-8-1- خصوصیات………………………………………………………………………………………37
1-8-2- عملکرد………………………………………………………………………………………….38
1-9- ارزیابی کیفیت رویان……………………………………………………………………………..41
1-10- سلولهای رویانی………………………………………………………………………………..43
فصل دوم: مروری بر متون گذشته
2-1- اثرات انجماد بر روی تخمک………………………………………………………………………46
2-2- اثر روش انجماد شیشهای……………………………………………………………………….47
2-3- بیان زیر واحدهای پمپ Na/K ATpase در تخمک و جنین……………………………………..48
2-4- پمپ Na/K ATpase ……………………………………………………………………………
2-5- آکواپورینها…………………………………………………………………………………………..51
2-6- هچ یا تفریخ………………………………………………………………………………………..52
2-7- فعال شدن ژنوم رویانی……………………………………………………………………………55
2-8- متابولیسم رویان…………………………………………………………………………………..56
2-9- نقش آلدوسترون در بیان پروتیین Na/K ATpase………………………………………………
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- تولید جنین های حاصل از لقاح خارج رحمی (IVF)
3-1-1- جمعآوری تخمدانها از کشتارگاه و استحصال تخمکها از مایع فولیکولی……………….61
3-1-2- بلوغ آزمایشگاهی تخمکها (IVM)………………..……….…….………………………………62
3-1-3- لقاح داخل آزمایشگاهی (IVF)…………………………………………………………………63
3-1-3-1- آماده سازی اووسیتهای بالغ شده برای لقاح………………………………………………63
3-1-3-2- آماده سازی اسپرم…………………………………………………………………………….63
3-1-4- کشت داخل آزمایشگاهی جنین های حاصل از(IVF)………………………………………..64
3-1-5- تازه كردن محیط کشت جنینها…………………………………………………………………65
3-2- تهیه محلولهای انجمادی…………………………………………………………………………..65
3-3- مراحل انجام روند انجماد شیشه ای………………………………………………………………66
3-4- محیط ذوب…………………………………………………………………………………………….66
3-5- گروههای آزمایشی و طراحی مطالعه…………………………………………………………….66
3-6- ارزیابی جنینها
3-6-1- ارزیابی کیفی جنینها با استفاده از رنگآمیزی افتراقی……………………………………..68
3-7- ایمونوسایتوشیمی پروتئینهای سطحی جنین های گوسفندی(Sheep embryo ICC)……..70
فصل چهارم: نتایج
4-1- تخمکهای منجمد شده
4-1-1- گروه آزمایشی اول، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمکهای منجمد-ذوب شده در مرحله GV
4-1-2- گروه آزمایشی دوم، افزودن آلدوسترون در روز چهارم
جنینی (D4)، به محیط کشت جنینهای حاصل از تخمکهای منجمد-ذوب شده…………………..82
4-1-3- گروه آزمایشی سوم، افزودن آلدوسترون در طی IVM، ومتعاقباً انجماد تخمک ها در مرحله MII
4-1-4- گروه آزمایشی چهارم، یا گروه کننرل………………………………………………………….83
4-2- تخمک های منجمد نشده
4-2-1- گروه آزمایشی پنجم، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمکهای غیر منجمد…………..85
4-2-2- گروه آزمایشی ششم، افزودن آلدوسترون در روز چهارم جنینی (D4)، به محیط کشت جنینهای حاصل از تخمکهای غیر منجمد…85
4-2-3- گروه آزمایشی هفتم، یا گروه کنترل………………………………………………………….86
4-3- فصل پنجم: بحث و پیشنهادات
بحث………………………………………………………………………………………………………89
نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………….. 94
پیشنهادات……………………………………………………………………………………………… 95
منابع…………………………………………………………………………………………………….. 96
خلاصه انگلیسی………………………………………………………………………………………..113
چکیده:
هدف: هدف از این مطالعه بررسی تآثیر آلدوسترون در افزایش توانمندی تکاملی تخمک های منجمد شده گوسفند با افزودن آلدوسترون در مرحله بلوغ تخمک و مرحله کشت جنینی می باشد.
مواد و روش ها: تخمک های حاصل از تخمدان های کشتارگاهی، بطور تصادفی به شش گروه آزمایشی تقسیم شدند: گروه های یک و دو: بلوغ تخمک های (IVM) منجمد شده و تازه در حضور آلدسترون و متعاقباً لقاح آزمایشگاهی تخمک ها (IVF) و کشت جنین های حاصله (IVC) (به ترتیب گروه هایVit-IVM و IVM). گروه های سه و چهار: IVM و IVF تخمک های منجمد شده و تازه، و متعاقباً IVC جنین های حاصله در حضور آلدوسترون در روز چهارم (D4) کشت جنینی (به ترتیب گروه های Vit-D4 و D4). گروه های پنجم و ششم: IVM، IVF و IVC تخمک های منجمد شده ( Vit-Cont) و تازه (Fresh-Cont) بدون حضور آلدوسترون. جنین ها در مراحل مورولا و بلاستوسیت، توسط آنتی بادی های اولیه بر علیه زیر واحدهایα1 و β1 پمپ Na+/K+/ATPase رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی شدند.
نتایج: میزان تفریخ در گروه هایی که در IVM و یا IVC آنها آلدوسترون افزوده شده بود، در هر دو گروه تخمک های منجمد شده و تازه (به ترتیب گروه های Vit-IVM، IVM، Vit-D4 و D4) در مقایسه با گروه های کنترل (به ترتیب Vit-Cont. و Fresh-Cont.) به طور معنی داری بیشتر بود. میزان بیان تحت واحد β1 پمپ Na+/K+/ATPase، در گروه های Vit-D4 و D4 به طور معنی داری بیشتر از سایر گروه های بود. همچنین نسبت ICM/Total نیز به طور معنی داری در گروه IVM بیشتر از سایر گروه ها بود.
بحث: به طور خلاصه، اضافه نمودن آلدسترون به محیط های کشت IVM و IVC می تواند موجب افزایش معنی دار میزان تفریخ در هر دو گروه تخمک های منجمد شده و تازه گردد. این افزایش میزان تفریخ ممکن است با میزان بیان بیشتر زیر واحد β1 پمپ Na+/K+/ATPase، که احتمالاً توسط افزودن آلدوسترون به محیط کشت القا گردیده است، در ارتباط باشد.
مقدمه و معرفی طرح:
در سالهای اخیرعلل مختلفی از قبیل بالا رفتن سن ازدواج، تعییر شیوه زندگی، عوامل عفونی و شیمیایی، اشعه و شیمی درمانی، مسائل ژنتیکی و یائسگی زود رس منجر به ناباروری زوجهای بسیاری شده و لذا انجماد و نگهداری تخمک اقدام اساسی در حفظ قدرت باروری و درمان ناباروری به شمار میرود. با توجه به ضرورت حفظ و نگهداری تخمک در روشهای کمک باروری[1](ART) تلاشهای زیادی جهت انجماد و نگهداری تخمکها صورت گرفته است، لیکن تاکنون روش قابل اعتمادی در انجماد تخمک که بتواند میزان بالایی از زنده مانی تخمکها را نشان دهد گزارش نشده است. علی رغم بررسی های متعدد صورت گرفته بر روی تغییرات مورفولوژیک، فراساختاری، فیزیولوژیک و عملکردی تخمک های منجمد- ذوب شده، هنوز اطلاعات اندكی در خصوص وقوع تغییرات ملکولی و بیوشیمیایی ایجاد شده در تخمک های مذکور و نیز الگوی بیان پروتیین های مرتبط با توان تكاملی تخمک ها پس از لقاح، به چشم می خورد. با توجه به مطرح بودن این گونه حیوانی به عنوان حیوان مدل انسان برای مطالعات تخمدان و تخمک، خطر انقراض برخی از نژادهای این گونه جانوری، اهمیت این گونه حیوانی از نظر اقتصادی (فراورده های دامی)، نقش آن به عنوان بیوراكتور در مطالعات مرتبط با تولید حیوان تراریخته و نیز عدم انجام مطالعه ای در خصوص بررسی ارتباط بین تجویز آلدوسترون و وضعیت بیان آنزیم Na+/K+/ATPase در روند تشکیل بلاستوسیست، در مطالعه حاضر به بررسی تاثیرآلدوسترون در بهبود کیفی تخمک های منجمد شده پرداخته خواهد شد.
بدین منظور تخمك های استحصال شده از تخمدان های كشتارگاهی گوسفند، در مرحله GV از تقسیمات میوزی به روش کرایوتاپ و با استفاده از روش انجماد شیشه ای منجمد و پس از گذشت یك هفته ذوب شده و پس از لقاح، مراحل تكاملی آنها در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار می گیرد.
فصل اول: کلیات
1-1- بیان مسأله
با وجود دستیابی به کارآیی نسبتاً بالا در تکنیک های انجماد اسپرم و جنین در پستانداران و از جمله گونه گوسفند، هنوز تکنیک مؤثری به منظور انجماد تخمک های این گونه حیوانی شناسایی نگردیده است. از جمله مهم ترین اهداف انجماد تخمک در نمونه های حیوانی می توان به حفظ و مدیریت ذخایر ژنتیکی، توسعه علم مهندسی ژنتیک، ارتقای تکنیک انتقال هسته[1] (NT) در روند شبیه سازی، تهیه منابع کافی جهت انجام تحقیقات بنیادین، صادرات کم هزینه صفات ژنتیکی برتر و ایجاد بانک تخمك اشاره نمود. علاوه بر این با حفظ و ذخیره سازی طولانی مدت این منابع (تخمك) امکان اعمال برنامه های مدیریتی قویتر در مورد گونه های جانوری در معرض خطر انقراض و در انسان نیز امکان حفظ باروری در زنان در معرض خطر اختلال در عملکرد تخمدان به علت درمانهای خاص (شیمی و پرتو درمانی)، جراحی، نارسایی زودرس تخمدان و … فراهم می گردد؛ ضمن این که انجماد تخمک در نمونه های انسانی هیچ یک از مشکلات و محدودیت های اخلاقی و حقوقی انجماد جنین را نیز به همراه ندارد. مطالعات نشان می دهند که در تخمک های منجمد- ذوب شده، آسیب های فراساختاری، مورفولوژیک، فیزیولوژیک و عملکردی متعددی به چشم می خورد که مهم ترین آنها عبارتند از: وارد شدن صدمات غیرقابل برگشت به غشاء پلاسمایی تخمك، کاهش نفوذپذیری انتخابی غشاء پلاسمایی، اگزوسیتوز زودرس گرانول های کورتیکال، سفت و سخت شدن زوناپلوسیدا، کاهش شدید میکروویلی ها، بهم ریختگی شدید اووپلاسم، تغییرات شدید و کاهش مشخص دستجات میکروتوبول ها و میکروفیلامان ها، بهم ریختگی دوک تقسیم و حرکت اجزاء اطراف سانتریول ها به مرکز تخمك، خرد شدن هسته، افزایش احتمال پارتنوژنزیس، کاهش شدید فاکتور پیشبرنده میتوز MPF[2]، کاهش مشخص متابولیت ها و پروتئین ها، آنپلوییدی و پلی پلوییدی اشاره نمود .
در این مطالعه به بررسی افزودن برخی عوامل مؤثر در روند اتجماد تخمک مانند آلدوسترون در محیط های اختصاصی کشت جنین و تأثیر آنها بر بیان پروتیین مورد نظر (Na/K ATpase)در مراحل مختلف جنینی
می پردازیم. بدیهی است نتایج حاصل از این مطالعه ضمن مشخص نمودن میزان تاثیر عامل افزوده شده بر روند تکامل تخمك و جنین های حاصله از انجماد، امكان ارتقای كیفی روش های انجمادی تخمك مبتنی بر نتایج بدست آمده را نه تنها در این گونه جانوری بلكه در سایر پستانداران از جمله انسان فراهم نموده و بدین ترتیب گامی موثر در جهت رفع معضل تکامل تخمک های انجمادی از مورولا به بلاستوسیست در پستانداران برداشته خواهد شد. لازم به ذکر است تا به حال تأثیر آلدوسترون در روند تکاملی جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده گوسفند بررسی نگردیده است و در صورت وجود تأثیر مثبت در این زمینه، موجب تحول روش های انجماد تخمک در گوسفند و حتی سایر گونه ها خواهد شد.
2-1- اهداف پژوهش
1- بررسی تأثیر هورمون آلدوسترون افزوده شده در طی IVM و مراحل مختلف جنینی بر عملکرد پمپ های Na+/K+/ATPase موجود در غشای بازولترال تروفکتودرم جنینی و برطرف شدن توقف جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده، در مرحله مورولا .
2- ارتقای پروتکل های انجماد تخمک در گوسفند با هدف ارتقای کیفی(جنینهای حاصله از افزایش میزان تفریخ، ICM/Total) عملکرد اجزای داخل سلولی و یا کاهش آسیب های ساختاری تخمک در روند تکامل جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده.
3-1- ضرورت انجام تحقیق
این پروژه با هدف پاسخ به برخی از سؤال های زیر طراحی گردید: بررسی تأثیر هورمون آلدوسترون افزوده شده در مراحل مختلف جنینی بر عملکرد پمپ های Na+/K+/ATPase موجود در غشای بازولترال تروفکتودرم جنینی و برطرف شدن توقف جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده، در مرحله مورولا؛ بررسی ارتباط بین تجویز هورمون های فعال کننده تحت واحد های 1α و 1β پمپ Na+/K+/ATPase و میزان افزایش عملکرد آنزیم مذکور در مرحله انتقال از مورولا به بلاستوسیست و متعاقباً بهبود روند تکاملی جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده و ارتقای پروتکل های انجماد تخمک در گوسفند با هدف ارتقای عملکرد اجزای داخل سلولی و یا کاهش آسیب های ساختاری تخمک در روند تکامل جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده.
4-1- تولید جنین در شرایط In vivo
1-4-1- روند ایجاد سلول جنسی ماده
واحدهای عملكردی تخمدان فولیكول نام دارند كه تحت سازماندهی سلولی خاص تخمک را در خود جای دادهاند. این سازماندهی سلولی ثابت نبوده و در طی مراحل مختلف زندگی فولیكول تغییرات پیچیدهای مییابد. حاصل این تغییرات به آزاد شدن تخمک و یا تحصیل فولیكول رسیده منجر خواهد شد ]132،54[.
تولید مثل با تكامل تخمكها در تخمدان آغاز میگردد. تعداد 1 تا 25 تخمك، بسته به گونه حیوان، در مرحلهای از سیكل جنسی حیوان ماده به نام فاز اوولاسیون از فولیكول تخمدانی به داخل حفره شكمی آزاد میشوند. سپس این تخمكها از طریق لوله رحمی مربوطه وارد رحم میشوند. فولیكولهای تخمدانی متعددی در مراحل مختلف تكاملی در استرومای كورتكس واقع شدهاند. بیشترین فولیكولها، فولیكولهای پریموردیال هستند. هر فولیكول پریموردیال حاوی یك تخمک اولیه است كه توسط یك لایه از سلولهای فولیكولی سنگفرشی احاطه شده است. در ادامه رشد این فولیكولها، سلولهای فولیكولی تبدیل به سلولهای مكعبی یا استوانهای كوتاه میشوند ]148،81 [.
مجموع وقایعی كه منجر به تولید سلول زایایی تخمک در جنس ماده میشود، باعث بروز تمامی واكنشهای لازم قبل، حین و بعد از واكنش با اسپرم در تخمک می شود که شامل یك پروسة طولانی از تمایز اووگونی در تخمدان جنینی تا بلوغ نهایی تخمک، درست قبل از اوولاسیون آن میباشد.
از مدتها قبل مشخص شده كه فقط تعداد كمی از تخمکهای اولیه حیوانات و نیز انسان میتوانند رشد ثانویه خود را دنبال کرده، تبدیل به تخمک ثانویه شده و تخمكگذاری كنند. بطور مثال در مورد گاو تخمین زده اند که در تخمدانهای گوساله تازه متولد شده حدود 200.000 تخمک وجود دارد که احتمالاً كمتر از 300 عدد آنها به مرحله تخمكگذاری میرسند] 52،136،20[.
فرم در حال بارگذاری ...
[سه شنبه 1399-10-09] [ 03:11:00 ق.ظ ]
|