1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی………………………………….. 31

 

1-7 ضرورت اهداف تحقیق………………………………………………………… 33

 

فصل دوم: مواد و روش­ها…………………………………………………………… 35

 

2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی……………………………………….. 36

 

2-2 جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ…36

 

2-2-1 طرز تهیه محیط کشت a-MEM…………………………………………….

 

2-2-2 طرز تهیهPBS   فاقد كلسیم و منیزیم (2/7 : PH)………………………. 37

 

2-2-3 طرز تهیه تریپسین/ EDTA…………………………………………………

 

2-2-4 روش جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان……………… 39

 

2-2-5 پاساژ سلولی……………………………………………………………… 39

 

2-3 تأیید هویت سلول‌های استرومایی به روش ایمونوسیتوشیمی………. 39

 

2-3-1 ایمونوسیتوشیمی CD71………………………………………………..

 

2-3-1-1 طرز تهیه پارافرمالدئید 4%…………………………………………….. 41

 

2-3-1-2 طرز تهیه ژلاتین 1/0 درصد…………………………………………….. 41

 

2-3-1-3 ساخت سرم بز 10%…………………………………………………… 41

 

2-3-1-4 طرز تهیه PBS  ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH)……………….. 42

 

2-3-1-5 طرز تهیه بافر گلیسرول………………………………………………….. 42

 

2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز………………………………………………. 43

 

2-4بررسی مارکر عصبی  βIII-tubulin در سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان  به روش ایمونوسیتوشیمی….44

 

 2-5 تایید هویت عصبی نوروسفر­ها به روش ایمونوسیتوشیمی…………… 45

 

2-6 بررسی مولكولی بیان ژن­های اعضای خانواده نوروتروفین……………….. 46

 

2-6-1 استخراج RNA كل از سلول‌های كشت شده …………………………..46

 

2-6-2بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده…………………………….. 48

 

2-6-3 الكتروفورز ژل آگارز …………………………………………………………49

 

2-6-4 واکنش ساخت cDNA (واکنش رونویسی معکوسRT-)……………… 52

 

2-6-5 انتخاب پرایمر……………………………………………………………… 53

 

2-6-6 آماده‌سازی پرایمرها……………………………………………………… 54

 

2-6-7 واكنش PCR……………………………………………………………….

 

2-7 آنالیز آماری………………………………………………………………….. 58

 

فصل سوم: نتایج…………………………………………………………………. 59

 

3-1 مشاهده مورفولوژی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت….59

 

3-2 تعیین هویت سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز….60

 

3-3 ویژگی­های مورفولوژیکی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت….60

 

3-4 تأیید هویت سلول‌های عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی….60

 

3-5 تأیید هویت نوروسفر­ها با استفاده از نشانگر نستین……………….. 61

 

 

3-6 ارزیابی بیان ژن­های فاكتورهای نوروتروفیك و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باند­ها و نمودار­های مربوط به آن…61

 

4-1 نتیجه ­گیری و بحث………………………………………………………… 70

 

4-1 مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آن­ها…71

 

4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلول­های بنیادی مزانشیمی…72

 

4-3 پتانسیل تمایز سلول­های بنیادی مغز استخوان به سلول­های عصبی……74

 

4-4 تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مغز استخوان در كشت طولانی مدت….76

 

4-5 نتیجه گیری…………………………………………………………………… 77

 

پیشنهادات…………………………………………………………………………. 77

 

مراجع ………………………………………………………………………………..79

 

چکیده:

 

هدف : هدف ما در این پژوهش پاسخ به این سوال است که  آیا MSCs  بعد از کشت طولانی مدت می­توانند به طورخود­بخودی به سلول­های پیش­ساز عصبی تمایز یابند.

 

مواد وروش­ها: این تحقیق شامل دو گروه می­باشد: کشت پاساژ پنجم MSCs  در محیط کشت -MEMα و  FBS %10  به مدت سه هفته بدون تعویض محیط یا استفاده از  القاگر به عنوان گروه آزمایشی و پاساژ پنجم MSCs بدون کشت طولانی مدت به عنوان گروه کنترل. سپس هر گروه توسط واکنش زنجیره­­ای پلیمراز(RT- PCR) به منظور بیان ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک ( NGF، BDNF، NT3، NT4/5و GDNF) و ژن­های نورونی (Nestin،TH  وNurr1) ارزیابی شد. در این مطالعه، از ایمینوسیتوشیمی Nestin و βІІІ-tubulin  به منظور تعیین سلول­هایی که این نشانگر­ها را بیان می­کنند استفاده شد.

 

نتایج: پاساژ پنجم MSCs که از موش صحرایی بالغ استخراج شدند، بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) قادرند بطور خودبخودی به سلول­های شبه نوروسفری تمایز یابند و به نشانگر نستین پاسخ مثبت می­دهند. بعد از هفته دوم کشت، سلول­های شبه نورونی به نشانگر  βІІІ-tubulin واکنش مثبت نشان دادند. بررسی­های آماری نشان داده است که  MSCs در گروه آزمایشی افزایش معنی­داری از ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک  NGF و  GDNFو ژن­های نورونی  Nestinو Nurr1 را نسبت به گروه کنترل نشان دادند    .(p<0.05)  

 

نتیجه گیری:  در این مطالعه نشان داده شد که MSCs در کشت طولانی مدت، به طورخودبخودی به نوروسفر تمایز پیدا می­کنند بدون اینکه با فاکتور رشد یا القا­کننده خاص همراه شوند و قادرند ژن­های اختصاصی نورون­های دوپامینرژیک مانند  THو Nurr1را بیان کنند. مطالعات ما نشان می­دهد که  MSCsدر شرایط کشت طولانی مدت توانایی تمایز به سلول­های نورونی را به طور خودبخودی دارا هستند و پیشنهاد می­شود منبع سلولی مناسبی در درمان بیماری­های نورولوژیکی باشند.

 

فصل اول: مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته

 

مقدمه:

 

امروزه تحقیق بر روی سلول­های بنیادی به دانش پیشرفته­ای تبدیل شده است که نه تنها در حیات علمی، بلکه در بعد اقتصادی نیز موثر قلمداد می­شود ]1[. سال­هاست که این تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسیم سلولی آیا می­توان درمان را بر پایه این سلول­ها بنا نهاد. این تفکر و تحقیق به تدریج به طرف طب جدیدی سوق داده می­شود که از آن به عنوان reparative (regenerative) medicine نام برده می­شود] 2[. پر واضح است برای رسیدن به این هدف، درک کامل بیولوژی سلولی و ماهیت سلول­های بنیادی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. خصوصا” علی­رغم تحقیقات وسیع، هنوز ابهامات متعددی پیرامون نحوه عملکرد سلول­های بنیادی وجود دارد ]3[.

 

سلول­های بنیادی، سلول­های زایای غیر بالغ­اند که قادر به خود تکثیری (Self-renewal) هستند و از این طریق جمعیت سلولی خود را حفظ می­کنند]4[. هر سلول بنیادی در کنام یا نیچ تنظیمی خود قرار گرفته است. کنام یک سلول، مجموعه­ای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلول­های بنیادی، تنظیم توازن بین خود نوزایی و تمایز است. یکی از مکانیسم­های تنظیم کننده این توازن کنترل تقسیم متقارن و نامتقارن می­باشد. در تقسیم نامتقارن، از تقسیم سلول ­بنیادی دو سلول دختری ایجاد می­گردد که یکی در کنام باقی مانده و دیگری کنام را ترک کرده تا تعداد زیادی پیش­ ساز ایجاد نماید و در نهایت به سلول­های بالغ تمایز پیدا می­کنند. در عوض در تقسیم متقارن، دو سلول­دختری ایجاد می­گردد که هر دو در کنام باقی مانده و به صورت بنیادی باقی می­مانند] 5، 6[. بنابراین سلول­های بنیادی، سلول­های تمایز نیافته­ای می­باشند که توانایی خود تکثیری، تولید نسل تمایز یافته عملکردی و ترمیم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[.

 

سلول­های بنیادی بر اساس قابلیت تمایز به سه گروه تقسیم می­شوند:

 

همه توان: جزء اولین سلول­هایی هستند که در جنین شکل می­گیرند ( از تخمک لقاح یافته 1-3 روزه)،  قابلیت تمایز به انواع سلول­های ارگانیسم را دارند] 4[.

 

پر توان: از توده سلولی داخلی در مرحله بلاستوسیست 100تا 200 سلولی منشاء می­گیرند. این سلول­ها دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند]7[.

 

چند توان: این گروه را سلول­های بنیادی بالغ و یا سلول­های بنیادی سوماتیك نیز می‌نامند که بصورت خاموش و غیر متعهد حفظ می­شوند تا در آینده و بر اساس نیاز فعال شده و به سایر دودمان­های مربوط به همان بافت تمایز یابند]8[، به عنوان مثال سلول­های بنیادی خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلول­های خونی مانند گلبول‌های قرمز، لنفوسیت‌های B وT  و … تمایز می‌یابند [9،10[.

 

سلول­های بنیادی از لحاظ منشاٴ به دو دسته­ی، سلول­های بنیادی جنینی (ESCs) و سلول­های بنیادی بالغ تقسیم می­شوند. از آنجا که استفاده از سلول­های بنیادی جنینی با مسائل اخلاقی و قانونی بسیار مواجه است و یا پیوند این سلول­ها خطر ایجاد بافت توموری را در پی خواهد داشت ]7،11[، بنابراین کلید حل این مشکل به دست آوردن منبع عظیمی از سلو­ل­هاست به گونه­ای­که قابلیت تمایز بالایی داشته باشد و قادر باشند به دفعات نامحدودی در محیط کشت تکثیر شوند تا تعداد کافی سلول قابل دسترس برای پیوند و یا هر کاربرد درمانی و پژوهشی فراهم آورد]4[.

 

سلول­های بنیادی مزانشیمی از مهم­ترین سلول­های بنیادی بالغ است. این سلول­ها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein  و Petrokova در سال 1966 استخراج شدند ]12[. سلول­های بنیادی مزانشیمی توان تمایز به چندین دودمان سلولی ازجمله استخوان، عصب، غضروف و كبد را دارند] 13 .[این سلول­ها به عنوان یك منبع ایده­آل برای سلول درمانی، ژن درمانی و به عنوان ابزاری برای درمان بیماری­های مادرزادی محسوب می­گردند] 14[. گزارش­هایی مبنی بر استفاده از این سلول­ها در مدل­های حیوانی برای درمان جراحات نخاعی] 15،16[، سكتة مغزی ]17 [و پاركینسون] 18 [وجود دارد.

 

1-1- سلول­های بنیادی جنینی

 

اولین تحقیقات در زمینه  ESCs در دهه 1960 شروع شد، هنگامیکه Finch و   Ephrussii درسال1960 ، سلول­های سرطانی جنینی چند توان را از سلول­های زایای سرطانی تمایز نیافته انسان و موش جدا کردند] 19.[

 

این سلول­ها اولین بار در سال1981 از توده سلولی داخلی جنین موش جدا سازی شدند، سپس در سال 1998، سلول­های بنیادی جنینی انسان استخراج شدند] 20،10.[ سلول­های بنیادی جنینی فعالیت تلومرازی شدیدی دارند و قادرند به طور نامحدودی تقسیم شوند، به گونه‌ای كه سلول­های بنیادی جنینی انسانی را می‌توان در شرایط محیط كشت تا بیش از یكسال به صورت تمایز نیافته حفظ كرد و جمعیت آنرا به 80 برابر رساند] 10.[  حضور آلکالین فسفاتاز و تلومراز و بیان نشانگر اختصاصی SSEA-1 از ویژگی­های اختصاصی سلول­های بنیادی جنینی می­باشد] 21.[