1-4-1 انتقال از طریق نیش پشه خاکی………………………………………………………. 19

 

1-4-2  انتقال مکانیکی…………………………………………………………………………. 19

 

1-4-3 انتقال از راه خون……………………………………………………………………….. 19

 

1-4-4 انتقال مستقیم…………………………………………………………………………… 19

 

1-5 بیماری­زایی لیشمانیا…………………………………………………………………………. 20

 

1-5-1 خصوصیات بیماری لیشمانیا………………………………………………………….. 19

 

1-5-2 لیشمانیوز احشایی……………………………………………………………………….. 20

 

1-5-3  لیشمانیوز جلدی پس از کالاآزار (PKDL)…………………………………………….. 21

 

1-5-3-1 لیشمانیوز جلدی و اشکال بالینی آن………………………………………………… 22

 

1-5-3-2  لیشمانیوز جلدی خشک…………………………………………………………….. 22

 

1-5-3-3 لیشمانیوز جلدی مرطوب…………………………………………………………….. 22

 

1-5-3-4 لیشمانیوز جلدی مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas)………………….. 23

 

1-5-3-4-1 شکل لوپوئید یا عود کننده سالک (Lupoid or Recidivan form)………………. 24

 

1-5-3-5  لیشمانیوز جلدی- مخاطی……………………………………………………………. 24

 

1-6 ایمنولوژی عفونت­های لیشمانیا……………………………………………………………… 25

 

1-6-1  مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز پوستی………………………………………… 25

 

1-6-1-1 نقش آنتی بادی یا ایمنی همورال…………………………………………………….. 25

 

1-6-1-2 نقش ایمنی سلولی در لیشمانیوز جلدی…………………………………………… 26

 

1-6-1-3 عمل سلولهای نوتروفیل و ماكروفاژ در لیشمانیوز………………………………….. 26

 

1-6-1-3  عملکرد T-CELL……………………………………………………………………….

 

1-6-2  مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز احشایی………………………………………. 28

 

1-6-2-1 نقش ایمنی همورال در كالاآزار…………………………………………………………. 28

 

1-6-2-3 نقش ایمنی سلولی در كالاآزار………………………………………………………… 28

 

1-6-2-4 .نقش مهم سلول های CD⁺4……………………………………………………..

 

1-7  روشهای تشخیص و مطالعه لیشمانیوز…………………………………………………. 30

 

1-7-1 روشهای مستقیم تشخیص انگل………………………………………………………. 30

 

1-7-1-1 . جداسازی انگل از کناره ضایعات پوستی یا بافتهای آلوده…………………………. 31

 

1-7-1-1 رنگ آمیزی……………………………………………………………………………….. 31

 

1-7-1-2 کشت انگل……………………………………………………………………………….. 32

 

1-7-2  روشهای ایمنولوژی در شناسایی انگل…………………………………………………. 32

 

1-7-2-1 آزمایشات سرولوژی برای بررسی ایمنی همورال…………………………………… 32

 

1-7-2-2 آزمایشات ایمنولوژیکی جهت بررسی ایمنی سلولی……………………………… 33

 

1-7-2-2-1 تستهای پوستی……………………………………………………………………… 33

 

1-7-2-3 ماهیت پاسخهای ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH)…………………………………… 34

 

1-7-3 آزمون پوستی لیشمانین یا تست مونتنگرو……………………………………………….. 35

 

1-7-3-1 معرف آنتی­ژنی لیشمانین برای تست پوستی………………………………………… 35

 

1-7-4 تست سنجش تکثیر لنفوسیتی  ymphocyte proliferation test(L.T.T) …………….

 

فصل دوم : مروری بر متون گذشته

 

فصل سوم: مواد و روشها

 

3-1کشت انگل………………………………………………………………………………………. 43

 

3 -1-1  مواد مورد نیاز جهت كشت انگل………………………………………………………….. 43

 

 

3-1-2. وسایل مورد نیاز جهت كشت انگل……………………………………………………….. 43

 

3-1-3. طرز تهیه محیط كشت مایع RPMI- 1640‌…………………………………………………

 

3-1-4. طرز تهیه محیط كشت كامل………………………………………………………………….. 44

 

3-1-5. طرز تهیه محیط كشت NNN……………………………………………………………….

 

3-1-6. طرز تهیه (PBS) Phosphate Buffered Saline…………………………………………..

 

3-1-7. روش كشت انگل……………………………………………………………………………. 45

 

3-1-8. روش شمارش سلولها………………………………………………………………………. 46

 

3-1-8-1. مواد و وسایل لازم جهت شمارش انگل………………………………………………… 46

 

3-1-8-2. شمارش با لام نئوبار……………………………………………………………………… 46

 

3-2. جداسازی انگلها با limiting dilution assay……………………………………………….

 

3-2-1. مواد و وسایل مورد نیاز برای Limiting dilution assay……………………………….

 

3-2-2. مراحل Limiting dilution assay…………………………………………………………

 

3-3. تهیه کرایو برای ذخیره در بانک سلولی…………………………………………………….. 50

 

3-3-1. مواد و وسایل لازم جهت تهیه کرایو……………………………………………………… 50

 

3-4 تهیه آنتی­ژن Freeze – thaw از انگلها جهت درهم ریختگی غشاء و بروز تمامی آنتی­ژن­ها…. 52

 

3-5 الکتروفورز آنتی­ژن­های پروتئینی در ژل پلی­آکریل­آمید ( SDS-PAGE )……………………….. 53

 

3-5-1 اصول الکتروفورز در ژل پلی­آکریل­آمید……………………………………………………….. 53

 

3-5-2 سیستم بافری………………………………………………………………………………. 54

 

3-5-3  مواد و وسایل مورد نیاز برای SDS-PAGE………………………………………………..

 

3-5-4 آماده­سازی نمونه………………………………………………………………………….. 57

 

3-5-6 طرز تهیه بافر الکترود…………………………………………………………………………. 57

 

3-5-7. روش انجام SDS-PAGE…………………………………………………………………….

 

3-5-8 روش رنگ­آمیزی با کوماسی آبی R- 250…………………………………………………

 

مواد مورد نیاز رنگ­آمیزی کوماسی آبی R- 250:………………………………………………..

 

3-6 سنجش میزان پروتئین تام با Bradford assay…………………………………………..

 

3-6-1 مواد و معرف­های مورد نیاز تست Bradford……………………………………………..

 

3-6- 2 روش کار سنجش پروتئین تام……………………………………………………………. 61

 

3-7 تست Lymphocyte transformation test (L.T.T)………………………………………..

 

3-7-1 روش انجام تست L.T.T………………………………………………………………….

 

1-3-7-1. مواد و وسایل لازم جهت انجام تست L.T.T………………………………………..

 

3-8 ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………………………………………. 66

 

3-8-1 مواد و وسایل مورد نیاز ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………….. 67

 

3-8-2  نحوه ایمنی­زایی در خوکچه………………………………………………………………… 67

 

3-9 تزریق داخل پوستی آنتی­ژن­ها و سنجش میزانDTH…………………………………..

 

3-9-1 مواد و وسایل لازم برای تزریق داخل پوستی و سنجش میزان DTH…………….

 

3-9-2  مراحل تزریق داخل پوستی………………………………………………………………. 69

 

3-9-3  نحوه سنجش میزان DTH………………………………………………………….

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1 کشت اولیه و جداسازی تک کلون­ها با روش limiting dilution………………………

 

4-2  بررسی پروفایل پروتئینی در آنالیز تک کلون­ها…………………………………………… 72

 

4-3 نتایج میزان پروتئین تام آنتی­ژن­ها به روش Bradford………………………………..

 

4-4 بررسی نتایج تست L.T.T………………………………………………………………

 

4-4-1  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن B…………………………………………….

 

4-4-2  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن C…………………………………………….

 

4-4-3.  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن D…………………………………………….

 

4-4-4 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن لیشمانین استاندارد (M)……………………… 76

 

4-4-5.  بررسی نتایج حاصل  از اندکس تحریکی تمامی آنتی­ژن­ها و میانگین آنها در مقایسه با Con-A

 

4-4-6 بررسی نتایج کلی L.T.T…………………………………………………………….

 

4-5 بررسی نتایج تست­های DTH بر روی خوکچه­های هندی………………………………. 79

 

4-5-1  نتایج تست DTH 24 ساعته………………………………………………………… 79

 

4-5-2 نتایج تست DTH 48 ساعته……………………………………………………………. 82

 

4-5-3 نتایج تست DTH 72 ساعته………………………………………………………… 83

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

 

منابع……………………………………………………………………………………………… 95

 

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………….. 106

 

خلاصه فارسی:

 

مقدمه: لیشمانیا ماژور یک انگل پاتوژن پروتوزوأ داخل سلولی است که عامل طیف وسیعی از عفونت­های پوستی با پیامدهای بالینی متنوع، از یک زخم پوستی خود بهبود شونده تا زخم­های گسترش یافته غیر بهبود شونده می­باشد. ایمنی سلولی نقش مهمی در مقاومت در برابر لیشمانیا ماژور بازی می­کند. واکنش­های حساسیت شدید دیررس که با تست­های پوستی لیشمانین تشخیص داده می­شوند یک روش تشخیصی برای سنجش ایمنی سلولی است و بطور وسیع برای سنجش اپیدمیولوژیکی افراد در معرض آنتی­ژن­های لیشمانیایی، سنجش واکسن­های کاندید و در کمک به تشخیص، مورد استفاده است. تست پوستی لیشمانین پبطور عمومی به نام تست مونتنگرو یا تست لیشمانین شناخته می­شود، که نیازمند یک آنتی­ژن استاندارد خالص و هموژن می­باشد.

 

هدف: تهیه و سنجش تک­کلون­های جداشده از لیشمانیا ماژور برای تست­ پوستی

 

روش: جداسازی تک­کلون­ها از سوش لیشمانیا ماژور مرجع (MRHO/IR/75/ER) به روش رقت دهی محدود شونده انجام گرفت. کلون­های جداشده با استفاده از روش­های برون­تنی، SDS-PAGE و تست تکثیر لنفوسیتی با استفاده از سلول­های تک­هسته­ای خون محیطی افراد  بهبود یافته از عفونت لیشمانیا ماژور مورد ارزیابی قرار گرفتند. توانایی هر تک­کلون جداشده با تست پوستی چهار خوکچه هندی ایمن شده دربرابر لیشمانیا ماژور مورد سنجش قرار گرفته شدند. تک­ کلون­ های جداشده به­همراه لیشمانین در ناحیه اصلاح شده شکمی حیوان­ها بطور داخل پوستی تزریق شدند.

 

نتایج: نتایج نشان دادند که سه نمونه از هفت تک­کلون­ ( نمونه D و(B,C در آنالیزهای SDS-PAGE یک تک باند را نشان دادند. این تک­کلون­ها برای سنجش در تست تکثیر لنفوسیتی مورد استفاده قرار گرفتند که همگی میزان ضریب تحریک (03/2±71/8، 65/2±71/8، 13/2±43/8 به ترتیب) قابل مقایسه­ای با لیشمانین ( 512/3±10) نشان دادند. سنجش درون­تنی تک­کلون­های جداشده، در خوکچه­های هندی نشان داد که هر سه تک­کلون میزان القاء قابل قبولی در مقایسه با لیشمانین از خود نشان دادند. بعلاوه، کلون C (83/0±333/7) میزان القاء معنادار بیشتری از لیشمانین ( mm00/4) در خوکچه­های هندی تست شده با آنتی­ژن C نشان داد.

 

یافته ­ها: اطلاعات نشان دادند که تک­ کلون­های جداشده توانایی القاء واکنش­های درون­تنی و برون­تنی قابل مقایسه­ای با لیشمانین استاندارد دارند و امکان استفاده جهت آنتی­ژن خالص و هموژن را در تست­های پوستی در مطالعات لیشمانیوزی را دارند

 

مقدمه:

 

انگل لیشمانیا یک پروتوزوای جنس لیشمانیا یک پاتوژن داخل سلولی است که می تواند باعث ایجاد طیف وسیعی از بیماری های انسانی از یک زخم پوستی ساده تا عفونت های احشایی شود که با گزش پشه خاکی آلوده به میزبان پستاندار از جمله انسان منتقل می­شود(99).

 

به بیماری­های حاصل از انگل های جنس لیشمانیا، لیشمانیازیس گفته می­شود. این بیماری در 88 کشور در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری جهان گسترش یافته است و اینک 12 میلیون نفر به این انگل مبتلا می باشند و350 میلیون نفر در خطر ابتلا به این بیماری قرار دارند. با وجود کوشش هایی که برای مبارزه با بیماری انجام شده، سالیانه 1 تا 2 میلیون مورد جدید جهانی گزارش می شود ، که 5/1 میلیون مورد از نوع جلدی و500هزار نفر از انواع احشایی می­باشد. در انسان بیماری به سه فرم بالینی جلدی (CL)[1]، جلدی مخاطی (ML)[2] و احشایی (VL)[3] بروز می­کند(57،83).

 

عفونتهای پارازیتی مثل لیشمانیوز می توانند در  بیماریهای ایمنوساپرس کننده مثلHIV پدیدار شود. عفونت توأم این بیماری­ها با لیشمانیوز بعنوان یک تهدید جدی در کشورهایی است که هر دو عامل پاتوژنیک را دارند( 106).

 

سازمان بهداشت جهانی آن را  در زمره 8 بیماری مهم انگلی دنیا با شیوع بالا در جهان قرار داده است. کنترل این بیماری از اولویتهای سیستم بهداشتی و درمانی جهان است و نیز از اولویتهای تحقیقاتی انیستیتو پاستور ایران نیز می­باشد(49).

 

افراد در تمام سنین در معرض ابتلا به این بیماری می باشند. بیش از %90 موارد ابتلا به لیشمانیای پوستی در کشورهای افغانستان، عراق، پرو، عربستان سعودی و متأسفانه ایران گزارش شده است( 47). این انگل امروزه بصورت انگلی فرصت طلب در افراد دچار نقص ایمنی درآمده است و به دلیل اینکه در ایران نیز موارد ابتلا به آن زیاد می باشد، لذا لازم است در زمینه شناخت بیشتر خود انگل و راه­های مقابله با آن مطالعات وسیعتری صورت گیرد.

 

فصل اول: کلیات

 

تعریف بیماری لیشمانیوز:

 

انگل پروتوزوای جنس لیشمانیا  یک پاتوژن داخل سلولی است که می تواند باعث بروز طیف وسیعی از بیماری های انسانی از یک زخم پوستی تا عفونت های احشایی شود. این انگل­ها با گزش پشه خاکی آلوده به میزبان پستاندار از جمله انسان منتقل می­شود( 47). این بیماری در نواحی روستایی و شهری بیشتر نقاط کشور وجود دارد. ناقل بیماری تنها یک سوم اندازه پشه معمولی است و به سختی با چشم دیده می شود. انسان در نوع شهری لیشمانیوز (سالک شهری) به عنوان میزبان اصلی محسوب می شود و به ندرت اتفاق می افتد که از مادر باردار به جنین یا با انتقال خون یا سوزن آلوده سرایت کند( 47).

 

این بیماری در انسان می تواند به اشکال مختلف بروز نماید و در مورد فرم احشایی در صورت عدم درمان حتی به مرگ منجر گردد(29،17). ژنوم این انگل در سال 2002 حدود 32 مگا باز ژنوم و8500 ژن تخمین زده شد که با ترجمه آنها بیشتر از 10000 پروتئین حاصل خواهد شد(16).

 

یکی از خصوصیات مهم انگل لیشمانیا، رشد و تکثیرآن در درون فاگولیزوزوم­های ماکروفاژها است. تعداد کمی از میکروارگانسیم ها قادرند که تحت چنین شرایطی ودر مجاورت انواع آنزیم های هیدرولیتیک زندگی کنند. بنابراین مراحلی که منجر به ورود انگل به درون فاگولیزوزوم می­گردد از اهمیت خاصی برخوردار است(77).

 

میزبان مهره دار برای انگل شامل میزبان پستاندار وخزنده است که میزبان پستاندار شامل انسان، سگ، سگ سانان و برخی جوندگان ودیگر جانوران وحشی می باشد. لیشمانیوزها عموما توسط گونه های پشه خاکی منتقل می شوند. ناقل این انگل ها در دنیای قدیم (همه قاره ها بجز آمریکا) پشه خاکی های متعلق به جنس فلوبوتوموس می باشد و در دنیای جدید گونه های مختلف پشه خاکی های ماده از جنس لوتزومیا
می­باشد(20،92،69،101).

 

عامل بیماری­زایی در لیشمانیوز، یعنی لیشمانیا، از راسته کینتوپلاست داران است که برحسب سیر تکاملی و محیط زیست خود به دو شکل بی تاژک یا آماستیگوت (یا جسم لیشمن) در درون سلولهای سیستم رتیکولواندوتلیال مهره داران مانند ماکروفاژها و شکل تاژکدار پروماستیگوت (یا لیپومونادی) در درون بدن پشه خاکی ناقل و محیط کشتهای مصنوعی مثل NNN[1] دیده می­شود (3).

 

2-1-1- تاریخچه لیشمانیوز در جهان

 

کانینگهام[1] در سال 1885 در فرانسه ترشحات زخم پوستی بیماری را که به آن تاول دهلی می گفتند، مورد مطالعه قرار دارد. این محقق، ماکروفاژهای میزبان را انگل آمیبی پنداشته و اجسام داخل ماکروفاژها را هاگ (اسپور) تصور کرده بود(64). رایت اجسامی شبیه به آنچه کانینگهام گزارش داده بود در زخم پوستی دختری که از ارمنستان به بوستون مهاجرت کرده بود مشاهده کرد. او این انگل را هلیکوزوماتروپیکوم نامید و فکر می کرد که متعلق به گروه میکروسپوریدیا باشد(3و18). در سال 1900 لیشمان[2] در طحال سربازی که از تب دام دام[3] در هندوستان مرده بود اجسام بیضی شکلی را در داخل سلول های بزرگی مشاهده کرد (دام دام شهری است که بیماری لیشمانیوزاحشائی در آن دیده شده بود). لیشمان نتیجه مطالعات خود را در سال1903 منتشر ساخت.