1-5-2-  مورفولوژی اکتینومیست‌ها……………………………….. 16

 

1-5-3-  فیزیولوژی اکتینومیست‌ها………………………………… 17

 

1-5-4- اکولوژی اکتینومیست‌ها…………………………………… 18

 

1-5- 5- طبقه بندی اکتینومیست‌ها ………………………………19

 

1-5-6- متابولیت‌های ثانویه……………………………………….. 20

 

1-5- 7- اکتینومیست‌های تولید کننده ترکیبات فعال…………… 21

 

1-5-8- تنوع شیمیایی ترکیبات تولید شده توسط اکتینومیست…..23

 

1-5-8-  اهمیت استرپتومیسس‌ها………………………………. 24

 

1-5-9-  اکتینومیست‌های دریایی……………………………….. 25

 

1-5-10-متابولیت‌های ضد قارچی و اهمیت اکتینومیست‌های دریایی….27

 

1-5- 11- اکتینومیست‌های دریایی، منبعی برای کشف داروی جدید……28

 

1-6- اهداف پژوهش………………………………………………….29

 

2- مواد و روش‌ها……………………………………………………. 32

 

2-1- دستگاه‌ها و تجهیزات………………………………………….32

 

2-2- محلول‎ها و مواد مورد نیاز ……………………………………33

 

2-3- جمع‌آوری نمونه………………………………………………. 36

 

2-4- غنی‌سازی و کشت اکتینومیست‌ها………………………..37

 

2-5- جداسازی و تهیه کشت خالص اکتینومیست‌ها…………….38

 

2-6- حفظ و نگهداری ذخایر کشت باکتریایی……………………..38

 

2-6-1- نگهداری کوتاه‌مدت………………………………………… 38

 

2-6-2- روش نگهداری بلند مدت…………………………………… 38

 

2-7- شناسایی باکتری‌ها ………………………………………….39

 

2-7-1- بررسی مورفولوژی………………………………………….39

 

2-7-2- بررسی مورفولوژی باکتریایی و رنگ‌آمیزی گرم…………..39

 

2-7-3-تولید پیگمان محلول………………………………………….40

 

2-8-غربالگری اولیه اکتینومیست های دارای فعالیت ضد باکتریایی….40

 

2-9- استخراج عصاره خام جدایه‌های فعال اکتینومیست……….41

 

2-10-غربالگری ثانویه برای یافتن متابولیت‌های ضد میکروبی…..41

 

2-10-1-بررسی فعالیت ضد باکتریایی سویه‌های فعال…………..41

 

2-10-2-بررسی فعالیت ضد قارچی سویه‌های فعال……………. 42

 

2-10-3-فعالیت سینرژیسمی عصاره خام اکتینومیست‌ها با آنتی بیوتیک…..43

 

2-10-4- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین….43

 

2-12-بررسی فعالیت اگزوآنزیمی سویه‌های فعال ……………….44

 

2-13- استخراج  نوکلئیک اسید به روش بیدبیتر ………………..44

 

2-14- الکتروفورز با ژل آگارز 8/0 درصد……………………………..45

 

2-15- تکثیر ژن rDNA 16S …………………………………………

 

2-15-1- برنامه PCR برای ژن‌های 16S rDNA:……………………

 

2-16- تخلیص محصول PCR………………………………………..

 

2-17- بررسی مولکولی ژن 16S rDNA…………………………..

 

2-17-1- تعیین توالی ژن 16S rDNA:……………………………..

 

2-17-2- انجام BLAST………………………………………………

 

 

2-17-3- رسم درخت فیلوژنی ژن 16S rDNA……………………

 

3- نتایج………………………………………………………………. 50

 

3-1- جداسازی اکتینومیست‌ها……………………………………. 50

 

3-2- غربالگری اولیه جهت شناخت جدایه‌های فعال…………….. 52

 

3-3- غربالگری ثانویه جدایه‌های فعال علیه باکتری‌های بیماریزا….55

 

3-4- بررسی فعالیت ضد قارچی جدایه‌های فعال…………………..56

 

3-5- فعالیت سینرژیسمی عصاره خام اکتینومیست‌ها با آنتی بیوتیک….58

 

3-6- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA)….59

 

3-7- فعالیت آنزیمی جدایه‌ها……………………………………….. 61

 

3-8- مورفولوژی اسپور کلنی و رنگ آمیزی جدایه‌ها……………… 61

 

3-9-تولید پیگمان محلول……………………………………………….65

 

3-10- استخراج نوکلئیک اسید و آنالیز آن با الکتروفورز……………..66

 

3-11- تکثیر ژن 16s rDNA جدایه‌های فعال…………………………..67

 

3-11-1- شناسایی مولکولی جدایه‌ها و رسم درخت فیلوژنی ژن 16S rDNA

 

4- بحث و پیشنهادات………………………………………………….. 73

 

4-1- جداسازی اکتینومیست‌های دریایی………………………….. 75

 

4-2- غربالگری سویه‌های اکتینومیست فعال……………………….. 75

 

4-3- استخراج متابولیت‌ها…………………………………………….. 76

 

4-4-غربالگری ثانویه عصاره خام جدایه‌های فعال…………………….. 76

 

4-5- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین…77

 

4-6- مورفولوژی کلنی‌ها………………………………………………. 78

 

4-7- بررسی توالی‌ 16S rDNA………………………………………..

 

4-8- جمع بندی ………………………………………………………… 79

 

4-9-پیشنهادات …………………………………………………………..81

 

چکیده:

 

اکتینومیست‌ها همواره به عنوان یک منبع اصلی تولید کننده آنتی‌بیوتیک‌های جدید و متابولیت‌های ثانویه متنوع، در داروسازی مورد توجه بوده‌ است. هدف از این تحقیق جداسازی اکتینومیست‌های تولیدکننده متابولیت‌های فعال از رسوبات بستر دریای مازندران و بررسی پتانسیل تولید متابولیت‌های ضدباکتریایی، ضد قارچی و آنزیمی توسط این ارگانیسم‌ها می‌باشد. رسوبات دریای مازندران از اعماق 5 و 10 متر جمع‌آوری شد. نمونه‌ها رقیق شده و برای جداسازی اکتینومیست‌ها در محیط کشت انتخابی استارچ کازئین آگار (SCA) کشت داده شد. جدایه‌ها توسط روش‌های مورفولوژی و میکروسکوپی کلنی‌ها، شناسایی و جداسازی شدند. غربالگری اولیه جهت یافتن جدایه‌های فعال با روش Cross streak انجام شد. متابولیت‌های تولید شده توسط جدایه‌های فعال، استخراج شد و بررسی فعالیت این عصاره خام علیه باکتری‌ها و قارچ‌های بیماریزا و باکتری‌های مقاوم به آنتی بیوتیک با استفاده از روش انتشار در دیسک بررسی شد. از رسوبات دریا، تعداد 80 جدایه اکتینومیست جداسازی و شناسایی شد. در غربالگری اولیه 7 جدایه دارای بهترین فعالیت ضدباکتریایی به عنوان اکتینومیست‌ فعال بررسی شدند. نتایج مرحله دوم غربالگری نشان داد که جدایه‌های فعال جداشده، فعالیت ضد قارچی خوب علیه گونه‌های کاندیدا و آسپرژیلوس داشتند. نتایج نشان داد که جدایه‌های MN39، MN2 و MN3 فعالیت ضد قارچی بیشتری نسبت به بقیه جدایه‌ها نشان دادند. همچنین سویه‌های MN2(16±1.4) و (18±1.4) MN39 دارای فعالیت بهتری نسبت به آنتی‌بیوتیک وانکومایسین (14±1.4) علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) نشان دادند. بررسی توالی ژن 16S rDNA سویه‌های فعال و رسم درخت فیلوژنی آن‌ها نشان داد که 7 جدایه فعال متعلق به جنسsp. Streptomyces می‌باشند. در این تحقیق به منظور بررسی فعالیت ضد میکروبی میکروارگانیسم‌های بومی ایران، برای اولین‌ بار از رسوبات بستر دریای مازندران، اکتینومیست‌ها جداسازی و مطالعه شدند. نتایج نشان داد که رسوبات بستر دریای مازندران می‌تواند به ‌عنوان منبع غنی از اکتینومیست‌های فعال که توانایی تولید متابولیت‌های ضد میکروبی جدید را دارند، مورد مطالعه دقیق‌تری قرار گیرد. بنابراین با  خالص‌سازی و مطالعه دقیق‌تر متابولیت‌های فعال اکتینومیست‌های رسوبات بستر دریای مازندران، بتوان آنتی‌بیوتیک‌های جدید و مناسب برای درمان بیماری‌های عفونی ناشی از میکروارگانیسم‌های مقاوم، معرفی کرد.

 

فصل اول: مقدمه

 

1- مقدمه

 

1-1- تاریخچه آنتی بیوتیک

 

مدت‌ها قبل از کشف پنی‌سیلین بشر آموخته بود به‌طور تجربی بعضی مواد خام را به عنوان عامل ضد میکروب مورد استفاده قرار دهد. ۶۰۰ – ۵۰۰ سال قبل از میلاد، چینی‌ها شیره کپک زده لوبیای شور را برای درمان عفونت‌ها بکار می‌بردند. در گذشته از عصاره گیاهانی مثل درمنه برای مقابله با کرم آسکاریس، از پوست درخت سینچونا[2] برای درمان مالاریا و از ریشه گیاه اپیکا در درمان اسهال استفاده می‌کردند اما مصرف دوز بیش از حد آنها عوارضی همچون سمیت، اختلالات شنوایی و بینایی داشت. از فلزات سنگین نیز در درمان بیماری‌ها استفاده می‌شد. از جیوه در درمان سفلیس و آرسنیک در درمان بیماری انگل تریپانوزوما استفاده می‌شد که به‌دلیل سمیت بالای این ترکیبات درمان را با مشکل مواجه می‌کرد. در سال 1910 پائول ارلیخ ترکیبات شیمیایی مختلف را به عنوان مواد ضد میکروبی آزمایش کرد و پایه گذار شیمی درمانی مدرن بود. او ارسفانآمین[4] را به عنوان اولین داروی موثر برای سفلیس معرفی کرد. کلمه آنتی بیوتیک از اصطلاح آنتی بیوز اولین بار در سال ۱۸۸۹ به‌وسیله ویلمین[6] برای توجیه ماهیت رقابتی جوامع بیولوژیک که در آن فقط قویترین و اصلح‌ترین زنده می‌ماند بکار برده شد و چند سال بعد این اصطلاح برای آنتاگونیسم[7] میکروارگانیسم‌ها نیز مورد استفاده قرار گرفت.

 

 آنتی بیوتیک‌ها مواد شیمیایی هستند که از میکروارگانیسم‌هایی مانند قارچ‌های میکروسکوپی و باکتری‌ها گرفته می‌شوند و از ادامه زندگی سلول‌های یوکاریوتی یا پروکاریوتی جلوگیری نموده و یا مانع تکثیر آنها می‌شوند در قرن 19 آقای لوئی پاستور و رابرت کخ باکتری‌ها را به عنوان عوامل بیماری معرفی کردند و کنترل آنهارا امری ضروری دانستند. تا قرن بیستم، داروهای نسبتا اندکی وجود داشت. در سال‌های اول قرن بیستم، پژوهشگران امور پزشکی امیدوار بودند که بتوانند با کشف یا ساخت داروهای جدید عامل عفونت را در داخل بدن از بین ببرند.

 

اولین کشف مهم در این زمینه بوسیله پزشک اسکاتلندی، الکساندر فلمینک در سال 1928 میلادی انجام گرفت. در تابستان سال 1928 فلمینگ مشغول تحقیق درباره آنفلوانزا بود. ضمن انجام كارهای معمول آزمایشگاهی كه می‌بایست كشت‌های باكتریایی را كه در ظرف‌های پهن در پوش‌دار رشد كرده بودند زیر میكروسكوپ بررسی كند، متوجه شد كه در یكی از ظرف‌ها ناحیه شفافی به وجود آمده است. تحقیقات بیشتر نشان داد كه ناحیه شفاف در اطراف نقطه‌ای بود كه وقتی سرپوش ظرف گذاشته نشده بود، تكه‌ای كپك به درون آن افتاده بود. فلمینگ با به خاطر آوردن تجربیاتش در زمینه لیزوزیم، نتیجه گرفت كه كپك چیزی تولید می‌كند كه باعث مرگ باكتری‌های استافیلوكوكوس در ظرف كشت شده بود. فلمینگ كپك را جدا كرد و آن را به عنوان یكی از اعضای جنس پنی‌سیلیوم شناخت، و ماده آنتی بیوتیكی را كه تولید می‌كرد پنی‌سیلین نامید. فلمینگ در ادامه نشان داد كه پنی‌سیلین برای جانوران سمی نیست و به یاخته‌های بدن آسیبی نمی‌رساند. به سبب ضرورت بهره‌گیری سریع از توانایی پنی‌سیلین در مقابله با بیماری‌ها و درمان زخم‌های نظامیان جنگ جهانی دوم، تولید آن در مقیاس گسترده، هم در انگلستان و هم در ایالات متحده، از اولویت‌های اول بود. استفاده از پنی‌سیلین نه تنها جان هزاران نفر را طی جنگ جهانی نجات داد، بلكه عاملی شد تا برای كشف آنتی بیوتیك‌های دیگر، از جمله خانواده‌ای از تركیبات مشابه شیمیایی پنی‌سیلین به نام سفالوسپورین‌ها، پژوهش‌هایی انجام گیرد.

 

 در سال 1945 جایزه نوبل در پزشكی به طور مشترك به او و فلوری[13] و چاین[14] داده شد (Clardy, 2009). با معرفی آنتی بیوتیک پنی‌سیلین به عنوان یک متابولیت ثانویه از کپک پنی‌سلیوم نوتاتوم[15] به دست آمد، دوران مدرن شیمی درمانی در سال 1940برای درمان بیماری‌های عفونی در انسان آغاز شد (Ligon, 2004). با کشف آنتی‌بیوتیک گرامایسیدین در سال 1939 به عنوان اولین عامل باکتری‌کش از یک باکتری جداشده شده از خاک (باسیلوس برویس[17]) نقطه آغاز جداسازی و غربالگری باکتری‌ها و قارچ‌های خاک برای دستیابی به آنتی بیوتیک‌های جدید آغازشد (Dubos, 1993) کشف آنتی‌بیوتیک استرپتومایسین در سال 1943 از باکتری استرپتومایسس، باکتری‌ها را درکانون توجه عموم برای کشف داروهای جدید قرار داد (Riedlinger, 2004).  استرپتومایسین اولین ترکیب از مجموعه متابولیت‌های ثانویه فعال زیستی بود که از اعضای جنس استرپتومایسس به دست ‌آمد و به عنوان آغاز مسیر تولید آنتی‌بیوتیک از سایر باکتری‌ها معرفی می‌شود (Berdy, 2005). در حالی که تعریف اصلی از آنتی بیوتیک‌ها  که توسط میکروبیولوژیست خاک واکسمن،کاشف استرپتومایسین، به شدت متکی بر متابولیت‌های مولکولی تولید شده توسط میکروارگانیسم‌هایی بود که باعث مهار رشد و یا از بین بردن میکروارگانیسم‌های دیگر می‌شد بود ولی امروزه این اصطلاح همچنین شامل عوامل به دست آمده از سایر منابع طبیعی و یا ترکیبات با منشاء نیمه سنتتیک یا مصنوعی نیز گفته می‌شود (Laskin, 2003).

 

1-1-1- مکانیسم عمل آنتی بیوتیک‌ها

 

بیشتر آنتی بیوتیک‌ها بر روی هر دو نوع سلول پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها اثر می‌گذارند و به همین دلیل نمی‌توان همه آنها را از نظر درمانی برای انسان مورد استفاده قرار داد. آنتی‌بیوتیک‌ها به دو گروه عمده‌ی عوامل کشنده یا سیدال که تمام سلول ها را می کشند و عوامل استاتیک که رشد باکتری را مهار می‌کنند طبقه بندی می‌شوند. در جدول شماره 1-1 مهمترین دارو‌های ضد میکروبی و مکانیسم اثر آن‌ها را نشان می‌دهد. آنتی بیوتیک‌ها از طریق چهار مکانیسم کلّی ویژگی باکتریوسیدی یا باکتریواستاتیکی خود را بروز می‌دهند.

 

1-1-1-1- جلوگیری از سنتز دیواره سلولی باکتری: باكتری‌ها یك لایه خارجی سخت دارند كه دیواره سلولی آنها است و شكل میكروارگانیسم را تعیین می‌كند و از سلول باكتری كه فشار اسموتیك بالایی دارد محافظت می‌نماید . آسیب به دیواره سلولی (توسط لیزوزیم) یا مهار تولید آن ، به متلاشی شدن سلول می‌انجامد. آنتی‌بیوتیک‌هایی که باعث مهار سنتز دیواره ی سلولی می شوند عبارتند از: پنی‌سیلین‌ها (پنی‌سیلین G، پنی سیلین V، آمپی سیلین، نفسیلین، تیکارسیلین،کاربنی‌سیلین، کلوکاسیلین)، سفالوسپورین‌ها، باسیتراسین، وانکومایسین، سیکلوسرین، نووبیوسین، تیکوپلانین، ریستوستین، فوزومیوسین و فسفونوپپتیدها.

 

2-1-1-1- مهار پروتئین سازی: آنتی بیوتیک‌های این گروه را می توان در دو گروه ممانعت کننده از نسخه برداری و ممانعت کننده از ترجمه تقسیم بندی کرد. گروه اول شامل اکتینومایسین که با اتصال به مولکول DNA مانع سنتز mRNA می شود و ریفامپین که با اتصال به آنزیم RNA پلی مراز مانع سنتز mRNA می‌شود. گروه دوم شامل آنتی‌بیوتیک‌های مهارکننده جزء30S ریبوزوم(آمینوگلیکوزیدها، آمینو سایکلیتول‌ها، تتراسایکلین ها) و آنتی بیوتیک‌های مهار کننده جزء 50Sریبوزوم(ماکرولیدها، لینکومایسین‌ها و تتراسایکلین).

 

3-1-1-1- جلوگیری از سنتز اسید نوکلئیک: این گروه شامل میتومایسن( به دو زنجیره مکمل DNA متصل شده و مانع جدا شدن و همانندسازی آن می‌شود)، اکتینومایسین ( به مولکول DNA متصل شده و مانع سنتز مولکول mRNA  می‌شود)، ریفامپین (به آنزیم RNA پلی مراز متصل شده و مانع سنتز mRNA می‌شود)، کینولون‌ها (نالیدیکسیک اسید؛ سینوکساسین و مشتقات فلورینه آن شامل نورفلوکساسین، سیپروفلوکساسین) می‌باشند.

 

4-1-1-1- تغییر در عملکرد غشاء سلولی: سیتوپلاسم تمام سلول‌های زنده توسط یك غشای سیتوپلاسمی محصور شده كه به‌عنوان یك غشای دارای نفوذپذیری انتخابی عمل می‌كند . این دسته با ایجاد تغییراتی در غشاء سلولی باعث افزایش نفوذپذیری و در نتیجه تخریب غشاء می‌شوند. نمونه این مكانیسم اثر پلی‌میكسین‌ها به طور مستقیم بر فسفاتیدیل اتانول آمین غشا در باكتری‌های گرم منفی می‌باشد و پلی ان‌ها که بر قارچ‌ها موثر هستند از دیگر داروهایی كه با مهار عمل غشای سلولی اثر می‌گذارند می‌توان به آمفوتریسین ب ، كلیستین، کلوتریمازول، کتوکونازول، ایمیدازول، تری آزول‌ها و یونوفورها اشاره كرد.

 

2-1-1- ژنتیک تولید آنتی بیوتیک

 

ژن تولیدکننده آنتی‌بیوتیک و دیگر متابولیت‌های ثانویه اکتینومیست‌ها معمولا به‌صورت کلاستر و یا به صورت پلاسمیدهای خطی بزرگ دیده می‌شوند. از نظر ژنتیکی آنتی بیوتیک‌ها با وزن مولکولی پائین، ساختار بسیار پیچیده دارند که نزدیک به 50 ژن در سنتز آنها دخالت دارد (Cundliffe, 2006). این در حالی است که یک ژن به آسانی می‌تواند یک پروتئین به وزن 100 کیلو دالتون را رمز گذاری کند(Challis, 2003). بعضی از جنس‌های استرپتومیسس بیش از 20 کلاستر ژنی را به سنتز متابولیت‌های ثانویه اختصاص داده‌اند. هر آنتی بیوتیک حدود 1% از کل ژنوم اکتینومیست تولید کننده را لازم دارد. علاوه بر ژن‌های لازم برای سنتز آنتی بیوتیک بعضی کلاستر‌ها دارای ژن‌های تنظیم کننده تولید آنتی بیوتیک می‌باشند (Cundliffe, 1989).

 

[1] . Clustered

 

[1] . Cidal