1-12) مواردکاربرد آنتی بیوتیک ها…………………………………………………………..24

 

1-13) ماکرولیدها………………………………………………………………………………27

 

1-14) اریترومایسین، ساختمان و ویژگی ها…………………………………………………30

 

1-15) تاریخچه تولید اریترومایسین………………………………………………………….31

 

1-16) نام ها و فرمول شیمیایی اریترومایسین……………………………………………32

 

1-17) مکانیسم عمل اریترومایسین………………………………………………………..32

 

1-18) فعالیت ضد میکروبی اریترومایسین…………………………………………………33

 

1-19) فارماکوکینتیک………………………………………………………………………….34

 

1-20) مصارف بالینی اریترومایسین………………………………………………………….34

 

1-21) عوارض جانبی اریترومایسین………………………………………………………….35

 

1-22) اشکال دارویی اریترومایسین…………………………………………………………..36

 

1-23) آنتی بیوتیک های مشتق شده از اریترومایسین…………………………………..36

 

1-24) مراحل کلیدی فرآیند تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین……………….38

 

1-24-1) حفظ و نگهداری کشت فعال…………………………………………………………39

 

1-24-2) تهیه مایه تلقیح به فرم سوسپانسیون اسپوری و توسعه آن…………………..44

 

1-24-3) مرحله پیش کشت یا بذردهی یا seeding …………………………………….

 

1-24-4) مرحله تخمیر یا Fermentation ………………………………………………….

 

1-24-4-1) تکنولوژی تخمیر آنتی بیوتیک……………………………………………………..48

 

1-24-4-1-1) تخمیر شیک فلاسک……………………………………………………………….48

 

1-24-4-1-2) فرمانتورهای همزن دار………………………………………………………….49

 

1-24-4-2) بررسی تأثیر عوامل مختلف برروی تخمیر و تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین…50

 

1-24-4-2-1) تأثیر محیط کشت تخمیر و ترکیبات مورد استفاده در آن………………………50

 

1-24-4-2-1-1) منابع کربنی………………………………………………………………………51

 

1-24-4-2-1-2) منابع نیتروژنی…………………………………………………………………..55

 

1-24-4-2-1-3) آب…………………………………………………………………………………57

 

1-24-4-2-1-4) مواد معدنی……………………………………………………………………..57

 

1-24-4-2-1-5) مواد مغذی پیچیده………………………………………………………………59

 

1-24-4-2-1-6) ویتامین ها و فاکتورهای رشد…………………………………………………..61

 

1-24-4-2-1-7) پیش ماده ها……………………………………………………………………..61

 

1-24-4-2-1-8) القا کننده ها و تحریک کننده ها……………………………………………….61

 

1-24-4-2-2) تأثیر pH……………………………………………………………………………..

 

1-24-4-2-3) تأثیر دما……………………………………………………………………………..64

 

1-24-4-2-4) تأثیر هوادهی………………………………………………………………………..67

 

1-24-4-2-5) تأثیر هم زدن………………………………………………………………………..68

 

1-24-4-2-6) تأثیر دی اکسید کربن……………………………………………………………..71

 

1-24-4-2-7) تأثیر کف…………………………………………………………………………….71

 

1-24-4-2-8) تأثیر استریلیزاسیون……………………………………………………………….73

 

1-24-4-2-9) تأثیر ویسکوزیته…………………………………………………………………..74

 

1-24-4-2-10) تأثیراریترومایسین تولید شده…………………………………………………..76

 

1-24-5) برداشت و خالص سازی محصول………………………………………………………77

 

1-25) سویا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی………………………………..79

 

 

1-25-1) علل انتخاب سویا و توسعه کشت آن…………………………………………………..79

 

1-25-2) تاریخچه سویا…………………………………………………………………………….80

 

1-25-3) تولید و مصرف جهانی سویا………………………………………………………………81

 

1-25-4) سویا در ایران……………………………………………………………………………82

 

1-25-5) اجزای ترکیبی سویا……………………………………………………………………..82

 

1-25-6) کنجاله سویا………………………………………………………………………………83

 

1-26) کلزا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی………………………………..83

 

1-26-1) علل عمده انتخاب کلزا و توسعه کشت آن…………………………………………….84

 

1-26-2) تاریخچه کلزا……………………………………………………………………………..85

 

1-26-3) تولید جهانی کلزا…………………………………………………………………………86

 

1-26-4) اجزای ترکیبی کلزا………………………………………………………………….86

 

فصل دوم : مروری بر متون گذشته

 

2-1) پیشینه پژوهش……………………………………………………………………………88

 

فصل سوم : مواد و روش ها

 

3-1) روش گردآوری اطلاعات و انجام پژوهش…………………………………………………..93

 

3-2) سویه باکتری مورد استفاده در پژوهش…………………………………………………..93

 

3-3) معرفی رنگ های مورد استفاده…………………………………………………………….94

 

3-4) محیط های کشت مورد استفاده…………………………………………………………..95

 

3-4-1) محیط کشت اسپورزایی………………………………………………………………….95

 

3-4-1-1) تهیه سوسپانسیون اسپوری…………………………………………………………98

 

3-4-2) محیط کشت مرحله بذردهی( پیش کشت_ seeding)……………………………….99

 

3-4-2-1) انتخاب بهترین ارلن در مرحله بذردهی…………………………………………….100

 

3-4-3) محیط کشت مرحله تخمیر………………………………………………………………104

 

3-4-3-1) غلظت های کنجاله سویا و کنجاله کلزا مورد استفاده شده در محیط تخمیر…….105

 

3-5) نمونه گیری…………………………………………………………………………………..106

 

3-6) سنجش اریترومایسین تولید شده………………………………………………………106

 

3-6-1) تهیه بافر کربنات بی کربنات با pH 6/9 ……………………………………………..

 

3-6-2) تهیه بافر با pH 6/9 اشباع از کلروفرم و کلروفرم اشباع از بافرpH 6/9 …………….

 

3-6-3) تهیه بافر سیترات_فسفات با pH 2/4………………………………………………

 

3-6-4) تهیه محلول بروموفنل بلو…………………………………………………………….108

 

3-6-5) تهیه محلول های استاندارد اریترومایسین………………………………………….109

 

3-6-6) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر با استفاده از کلروفرم…………………….111

 

3-6-7) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو……………………………112

 

3-6-8) اندازه گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو…………113

 

3-7) محیط کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین…………………………..113

 

3-7-1) محیط کشت مولر هینتون آگار………………………………………………………113

 

3-7-2) محیط کشت مولر هینتون براث…………………………………………………….114

 

3-7-3) استخراج اریترومایسین از محیط کشت تخمیر……………………………………..114

 

3-7-4) سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین………………………………………………..114

 

3-7-5) تهیه مایع تلقیح…………………………………………………………………………115

 

3-7-6) تهیه چاهک………………………………………………………………………………116

 

3-7-7) تهیه بافر فسفات با pH 8……………………………………………………………..

 

3-7-8) تهیه محلول های استاندارد…………………………………………………………..116

 

3-7-9) افزودن محلول های آنتی بیوتیک در پلیت ها……………………………………….117

 

3-7-10) اندازه گیری قطر هاله مهار رشد………………………………………………..117

 

3-7-11) رسم منحنی استاندارد………………………………………………………………117

 

3-8) سنجش غلظت اریترومایسین به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا…………….118

 

3-8-1) فاز متحرک………………………………………………………………………………..118

 

3-8-2) آماده سازی مایع تخمیر…………………………………………………………………118

 

3-8-3) اندازه گیری مقداراریترومایسین…………………………………………………………119

 

3-9) کروماتوگرافی لایه نازک TLC ……………………………………………………………..

 

فصل چهارم: نتایج پژوهش

 

4-1) بررسی اثر کنجاله سویا بر رشدSaccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین (محیط شاهد)…123

 

4-1-1) اثر کنجاله سویا در pH محیط کشت تولید اریترومایسین (کنترل)…………………….123

 

4-1-2) اثر کنجاله سویا بر درصد بیومس تولید شده (کنترل)……………………………….124

 

4-1-3) اثر کنجاله سویا در میزان تولید اریترومایسین ( کنترل)………………………………125

 

4-1-4) بررسی اثر کنجاله سویا بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea (کنترل)…125

 

4-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر تولید اریترومایسین…………………128

 

4-2-1) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر pH محیط کشت……………………129

 

4-2-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر بیومس تولیدی……………………130

 

4-2-3) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر میزان اریترومایسین تولیدی……….130

 

4-3) غلظت بهینه ترکیب کنجاله سویا و کلزا برای محیط کشت تولید اریترومایسین…………131

 

4-4) اثر ترکیب کنجاله سویا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر و کنجاله کلزا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر بر روی پارامترهای مورد بررسی درتخمیر………32

 

4-4-1) بررسی اثر غلظت بهینه در میزان تولید اریترومایسین………………………………….132

 

4-4-2) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی pH محیط کشت تخمیر……………………………….133

 

4-4-3) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی درصد بیومس تولیدی………………………………..133

 

4-4-4) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea………

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

 

5-1) تأثیر مواد تشکیل دهنده و ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک…137

 

5-1-1) اثر منابع نیتروژنی در تولید اریترومایسین…………………………………………………..137

 

5-1-1-1) مقایسه اثر غلظت های مختلف ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا به عنوان منبع نیتروژنی در تولید اریترومایسین…..138

 

5-2) همزمانی رشد Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین………………….144

 

5-3) رابطه بین میزان رشد باکتری و تغییرات بیومس در طول فرآیند……………………………145

 

5-3-1) سینتیک رشد میکروبی……………………………………………………………………..146

 

5-4) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده در این پژوهش و pH محیط کشت تخمیر………148

 

5-5) رابطه بین مورفولوژی سویه مولد و تولید اریترومایسین………………………………….149

 

5-6) برآورد هزینه ها………………………………………………………………………………..153

 

5-6-1) محاسبه میزان اریترومایسین تولیدی و قیمت تمام شده منبع نیتروژنی مورد استفاده در آن در هر Batch صنعتی….153 

 

5-6-1-1) استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا (محیط کنترل) در تخمیر……………………154

 

5-6-1-2) استفاده از ترکیب 15 گرم در لیتر کنجاله سویا و 15 گرم در لیتر کنجاله کلزا……..154

 

5-7) پیشنهادات………………………………………………………………………………………156

 

منابع و مراجع……………………………………………………………………………………..158

 

خلاصه انگلیسی………………………………………………………………………………….165

 

ضمائم ……………………………………………………………………………………………..166

 

چکیده:

 

امروزه یکی از مهم ترین و پرمصرفترین آنتی بیوتیک های مورد استفاده اریترومایسین می باشد که در درمان طیف وسیعی از بیماری ها مورد استفاده قرار می گیرد. برای تولید این آنتی بیوتیک پنج مرحله کلیدی وجود دارد که از بین این مراحل، مهم ترین و پر هزینه ترین مرحله که در آن اریترومایسین تولید می شود مرحله تخمیر است. ترکیبات محیط کشت مرحله تخمیر  نقش مهمی را در میزان تولید محصولات ثانویه و  پارامترهای تخمیر ایفا می کنند همچنین سوبسترای نیتروژنی یکی از اجزای اصلی محیط کشت در این مرحله و یکی از موارد اصلی هزینه در مخلوط محیط کشت می باشد. بنابراین استفاده از منابع نیتروژنی با قیمت مناسب و بازده قابل قبول از اهمیت ویژه ای برخوردار است . در این پژوهش اثرغلظتهای مختلف ترکیبی از دو منبع نیتروژنی کنجاله سویا و کنجاله کلزا در تولید آنتی بیوتیک اریترومایسین بررسی شده است. برای تولید اریترومایسین از باکتری رشته ای Saccharopolyspora erythraea   استفاده شده است. سوسپانسیون اسپوری به محیط بذردهی تلقیح شده و در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 40 تا 44 ساعت با دور rpm 200 در شرایط هوازی گرما گذاری شد و بهترین نمونه بذردهی به ارلن های حاوی محیط تخمیر اضافه شد و با pH اولیه 8/6 در شیکر انکوباتوردار با دمای 33 درجه سانتیگراد و دور rpm220 به مدت 11 روز گرما گذاری شد. در طول فرایند تغییرات مورفولوژیک باکتری ، pH ، درصد وزن تر بیومس تولیدی از روز چهارم به صورت یک درمیان اندازه گیری شد . میزان اریترومایسین تولید شده به روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد . غلظت های منابع نیتروژنی مورد استفاده عبارت بود از :

 

1- کنجاله سویا 15 گرم در لیتر و کنجاله کلزا 15 گرم در لیتر ( هر کدام 50 % محیط )

 

2- کنجاله سویا 18 گرم در لیتر ( 60 % ) و کلزا 12 گرم در لیتر ( 40 % )

 

3- کنجاله سویا 12 گرم در لیتر ( 40 % ) و کلزا 18 گرم در لیتر ( 60 % )

 

4-کنجاله سویا 21 گرم در لیتر ( 70 % ) و کلزا 9 گرم در لیتر ( 30 % )

 

5- کنجاله سویا 9 گرم در لیتر ( 30 % ) و کلزا 21 گرم در لیتر ( 70 % )

 

 بر طبق نتایج بدست آمده، استفاده از مخلوط 15 گرم در لیتر کنجاله سویا و 15 گرم در لیتر کنجاله کلزا ،دارای بالاترین میزان تولید اریترومایسین بوده و نسبت به استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا که حالت مورد استفاده در صنعت می باشد 011/1 برابر اریترومایسین بیشتری تولید نموده است.

 

مقدمه:

 

بیوتکنولوژی دانشی است که در رابطه با استفاده از موجودات و یا متابولیت های آنها جهت تولید فرآورده های مختلف دارویی ، غذایی ، شیمیایی و غیره در مقیاس صنعتی بحت می کند. روند تکاملی بیو تکنولوژی در طی هزاران سال شکل گرفته و نهایتا به علمی تبدیل شد که با جهت گیری کاربردی میکروبیولوژی و بیو شیمیایی ، ارتباط نزدیکی با مهندسی شیمی ایجاد نموده است ( 48 ).

 

بین انسانها و میکرو ارگانیسمها ، از ابتدا ارتباط حیاتی بسیار نزدیکی وجود داشته که این ارتباط می تواند مضر و یا مفید باشد. پس از آنکه رابرت کخ در سال 1880 برای اولین بار کشت خالص باکتری ها را به دست آورد ، توجه زیادی به عوامل بیماری زا شد و مطالعات بعدی نشان داد که با وجود این که برخی میکروبها عامل بیماری در انسان ، حیوان و گیاه هستند ، عده زیاد دیگری کاربرد صنعتی داشته و در تولید مواد غذایی، داروها ، آنزیم ها ، اسید های آمینه و غیره نقش دارند(52).

 

در دهه 1940 و 1950 که آنتی بیوتیکهای اولیه نظیر پنی سیلین کاربرد بالینی پیدا کرده و به عنوان داروهای ایجازگر شناخته شده بودند ، با از بین بردن بسیاری از باکتری ها عامل وخیم ترین بیماری های عفونی انسان ، جان میلیونها تن حفظ شد. اما مدتی پس از کشف آنتی بیوتیک ها ، به دلایل متعدد، از جمله استفاده نادرست و یا بیش از حد از آنها ، مثلا استفاده تنها جهت فربه کردن دام ، سویه های میکرو ارگانیسم در مقابل آنتی بیوتیک ها مقاوم شدند ، بطوریکه امروزه مجددا بیماری های عفونی ناشی از میکرو ارگانیسم ها تهدیدی جدی برای سلامتی در دنیا محسوب شده و هزینه های بسیار زیادی برای درمان آنها مصرف می شود.

 

طی سالهای 1925 تا 1965 استفاده از میکروبها در صنایع دارویی به صورت یک تحول اساسی زمینه را برای بکارگیری میکروارگانیسمها در تولید داروها و بویژه آنتی بیوتیکها فراهم ساخت و با گذشت زمان این روند تکامل یافت به طوری که امروزه بیو تکنولوژی در حال ورود به مرحله جدیدی است و به عنوان یک علم در عصر پیدایش و ساخت آنتی بیوتیکها توسعه چشم گیری داشته و در حال حاضر تولید انبوه فرآورده های میکروبی نظیر  آنتی بیو تیک ها  به صنعت چند میلیارد دلاری مبدل شده و از نقطه نظر اقتصادی ، آنتی بیوتیکها مهم ترین فراورده های صنعتی دنیای میکروبها محسوب می شوند(12).  بدین ترتیب بالا بردن راندمان تولید و اقتصادی تر کردن فرآیند تولید آنتی بیوتیک ها جز اهداف ضروری است که با تلاش متخصصین در شاخه های مختلف علوم نظیر میکرو بیو لوژی ، بیو شیمی، مهندسی شیمی،بیوتکنولوژی و غیره می توان به آن دست یافت. در صنعت بیوتکنولوژی برای تولید محصولاتی نظیر آنتی بیوتیک ها دو بخش عمده وجود دارد :

 

1- عملیات بالا دستی(Up stream ) : که شامل دو بخش توسعه سویه و توسعه محیط کشت و تخمیر است و در این بخش ها نقش مهندسی شیمی و میکروبیولوژیست حائز اهمیت است. هدف از بخش توسعه سویه ، شناخت، تهیه و تثبیت میکروارگانیسم مولد محصول و هدف از بخش توسعه محیط کشت ، بهینه سازی محیط کشت از نظر میزان و نوع مواد، شرایط تولید و اقتصادی تر نمودن فرآیند می باشد.

 

2- عملیات پایین دستی( D. stream) : در این بخش که در واقع فرآوری پس از تخمیر است، نقش مهندسان در جهت دهی فرآیند تخمیر به سمت نتایج بسیار مهم می باشد. هدف از این مرحله، جداسازی و خالص سازی محصول می باشد. ( 17)

 

فصل اول: کلیات