2-2- اثر گیاه برفعالیت وبیان ژن- 21

 

فصل سوم: مواد و روشها

 

1-3- موادو روشها————- 25

 

2-3- تهیه عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه—- 27

 

3-3- حیوانات آزمایشگاهی—— 28

 

1-3-3- نحوه گروهبندی:——- 28

 

2-3-3- روش القای دیابت تجربی:—————- 29

 

3-3-3- اندازه گیری قند و وزن موشها:———— 29

 

4-3-3- مراحل انجام تشریح:—- 29

 

4-3- بررسی بیان ژن———- 31

 

1-4-3- مشخصات توالی ژن PFK-1————- 31

 

2-4-3- طراحی پرایمرها——- 35

 

3-4-3- آماده سازی پرایمر—– 35

 

5-3- استخراج RNA:———- 36

 

1-5-3- استخراج RNA از نمونه های تازه کبد توسط کیت Geneall Hybrid Rtm

 

1-5-3- بررسی کمیت و کیفیت RNA  استخراج شدهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 38

 

6-3- سنتز cDNA————

 

1-6-3- سنتز cDNA توسط کیتThermo SCIENTIFICبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—-

 

7-3- واکنش های PCR——–

 

1-7-3 – PCR شیب دمایی—– 41

 

2-7-3- PCR معمولی——— 43

 

8-3- الکترفورز————— 45

 

1-8-3 – مواد مورد نیازجهت تهیه ژل الکتروفورز—- 45

 

1-1-8-3- آگارز————– 45

 

2-1-8-3- اتیدیوم بروماید—— 46

 

3-1-8-3- لودینگ بافر——— 46

 

4-1-8-3-طرز تهیه محلول Tris-Hcl————-

 

4-1-8-3- شناساگرهای اندازهDNA————–

 

9-3- روش کار با ژل الکترفورز— 47

 

10-3- رسم منحنی استاندارد:— 48

 

10-3- واکنش Real-Time PCR—————-

 

11-3- Threshold و مقدار CT:–

 

12-3- تعیین توالی محصولات  (Direct Sequencing) PCRبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———

 

10-2-3- آنالیز بیان ژن——– 52

 

13-3- تجزیه وتحلیل داده ها—- 52

 

 

فصل چهارم: نتایج و بحث

 

1-4- جمع آوری نمونه :——– 54

 

2-4- بررسی نتایج وزن موشهای مورد مطالعه——- 54

 

3-4- بررسی نتایج گلوکز ناشتای سرم موشهای مورد مطالعهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———- 56

 

5-4- نتایج استخراج RNA:—–

 

6-4- نتایج حاصل ازساخت cDNA بر روی ژل آگاروزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————— 59

 

7-4-  نتایج تعیین غلظت و کیفیت RNA توسط اسپکتروفتومتریبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 61

 

1-7-4-  نتایج مربوط به PCR شیب دمایی——– 61

 

8-4- نتایج منحنی استاندارد—- 62

 

1-8-4- منحنی استاندارد ژن TBP—————

 

2-8-4-منحنی استاندارد ژن PFK-1————-

 

9-4- نتایج واكنش  Real Time PCR————-

 

1-9-4- تکثیر ژنPFK———

 

2-9-4-تکثیر ژن TBP———

 

10-4- ارزیابی  کارایی تکثیر ژنهای مور مطالعه از طریق آنالیز منحنی ذوب:—— 66

 

1-10-4- منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن  PFKبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———–

 

2-10-4-منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن TBPبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————-

 

11-4-  آنالیز منحنی ذوب ژن PFK————–

 

12-4-آنالیز منحنی ذوب ژن TBP—————

 

13-4- نتایج حاصل از Real timePCR ژن PFK 1 بر روی ژل آگارزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد— 70

 

14-4- نتایج بررسی بیان ژن PK—————- 70

 

15-4- بحث:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 71

 

16-4- پیشنهادات————- 73

 

منابع:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 75

 

چکیده:

 

دیابت قندی یكی از مشكلات مهم پزشكی در همه كشورها می‌باشد. امروزه، درد و رنج انسان نه تنها در مورد این بیماری به خودی خود، بلکه شامل عوارض مرتبط با دیابت است.  گیاهان نشان دهنده منبع عظیمی از مکمل­های غذایی بالقوه مفید برای بهبود کنترل قند خون و جلوگیری از عوارض دراز مدت دیابت هستند. با توجه به تنوع گیاهان داروئی در ایران و با توجه به پتانسیل درمانی گیاهان داروئی و همچنین خطراتی كه داروهای شیمیایی ممكن است در حال حاضر یا آینده برای بیماران ایجاد كنند، با بررسی تاثیر گیاهان دارویی در بیماری دیابت می­توان راه­های درمان مناسبی در پیش رو قرار داد.آنزیم  فسفو فروکتوکیناز -1 از آنزیمهای سیتوزولی در مسیر گلیکولیز می باشد که نقش کلیدی در روند تنظیم گلیکولیز دارد.عوارض ناشی از نقص موروثی آنزیم pfk-1 در عضلات اسکلتی بصورت خستگی و کاهش توان حرکات عضلانی می باشد. در مواردی هم نقص آن باعث رشدسریع سلولهای سرطانی می شود. درتحقیق حاضر به  تاثیر عصاره هیدر الکلی برگ گیاه جغجغه (با توجه به دارا بودن اثرات ضدالتهابی، ضد میکروبی و ضد دیابتی ) بر بیان ژن pfk-1در موشهای دیابتی نوع 1می پردازیم.

 

در این مطالعه 45 سر موش صحرایی نر به طور تصادفی در سه گروه شاهد سالم، شاهد دیابتی و دیابتی تحت تیمار تجویز عصاره جغجغه تقسیم شدند. با تزریق استرپتوزوتوسین (mg/kg 60) در موش­های صحرایی نر (300-150 گرم) دیابت نوع 1 ایجاد شد.گروه دیابتی تحت تیمار به صورت روزانه (mg/kg 300) عصاره برگ گیاه جغجغه را به صورت گاواژ به مدت 30 روز دریافت نمودند. گروه شاهد سالم و شاهد دیابتی آب مقطر دریافت کردند. سپس در روز قبل از تجویز عصاره و روزهای 15 و 30 بعد از تجویز عصاره میزان گلوکز خون اندازه­گیری شد و بیان ژن PFK-1 بافت کبدی توسط روش Real-Time PCR بررسی گردید. نتایج نشان داد گلوکز خون در روز 15کاهش می یابد اما بین گروه شاهد دیابتی و دیابتی تحت تیمار تفاوت معنی داری مشاهده نشد میزان بیان ژن PFK در گروه دیابتی تحت تیمار در روز 15 تفاوت معنی داری نسبت به شاهد دیابتی ندارد در بین گروهها تفاوت معنی داری برای بیان ژنPFK  وجود ندارد. بنابراین تجویز عصاره هیدروالکی گیاه جغجغه بر بیان ژن فسفوفروکتوکیناز -1 در بیماران دیابتی نوع 1 بی تاثیر می باشد.

 

فصل اول: مقدمه و کلیات

 

1-1- مقدمه

 

دیابت یک بیماری ساده نیست، بلکه سندرم پیچیده­ای است که بارزترین ویژگی آن افزایش قند خون است. بنابراین، بیماران دیابتی هر چند در یک ویژگی به هم می­مانند، اما هم از نظر بالینی و هم از نظر آسیب شناسی و ژنتیکی ناهمگون هستند. این بیماری در سال 1980 میلادی این گونه تعریف شد: گروهی از نارسایی­ها که ویژگی اصلی آن­ها افزایش بیش از اندازه­ی گلوکز در خون و کاهش تحمل به گلوکز است و پیامد کمبود انسولین یا نارسایی در کارکرد انسولین و یا آمیزه­ای از این دو است. عوارض ناشی از دیابت در 25% موارد، نارسایی کلیه و در 50% موارد قطع عضو و نابینایی است (Tehranipour et al., 2008). گیاهان دارویی از قدیم به منظور کنترل قند خون، کاهش عوارض، افزایش کیفیت و طول زندگی در افراد دیابتی به کار گرفته شده است. با توجه به این که گیاهان دارویی نسبت به داروهای شیمیایی اثر جانبی کمتری دارند، بنابراین پژوهشگران به دنبال یافتن ترکیبهای گیاهی برای درمان و یا پیشگیری از این بیماری هستند. گیاه جغجغه (Prosopis farcta) گیاهی با خواص ضد التهاب و ضد دیابتی است. اهمیت فعالیت فسفوفروکتوکیناز 1 نه تنها از این جنبه است که واکنشی به شدت انرژی زا را کنترل می کند بلکه اولین مرحله در واکنش­های گلیکولایزیز است که واکنش یکطرفه بوده و برگشت ناپذیر است. این باعث می­گردد که کنترل شدیدی بر روی میزان گلوکز و دیگر مونوساکاریدها مانند گالاکتوز و فروکتوز بوجود آید.. هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر میزان بیان ژن پیروات کیناز و کاهش سطح گلوکز خون در موش‌های صحرایی نر دیابتی می‌باشد.