1-2-6 پروتئازها 11

 

1-2-6-1 اعمال پروتئازها. 12

 

1-2-6-2 دسته بندی پروتئازها. 17

 

1-2-7 کاربرد پروتئازها 22

 

1-2-7-1 صنعت شوینده. 22

 

1-2-7-2 صنعت چرم. 23

 

1-2-7-3 صنایع دارویی.. 24

 

1-2-7-4 صنایع غذایی.. 25

 

1-2-8 سراشیا مارسسنس… 26

 

1-2- 9 سراشیاپپتیداز و اهمیت آن. 28

 

نوترکیب و اهمیت آن. 29

 

1-2-11 انتخاب میزبان بیان ژن. 30

 

1-2- 12راهبردهای نسخه برداری (انتخاب حاملین بیان ژن) 31

 

.. 32

 

-14استراتژی خالص سازی محصول نوترکیب.. 34

 

هدف از انجام پروژه 36

 

فصل دوم: پیشینه پژوهش

 

2-1 ادبیات و سوابق مربوطه…39

 

فصل سوم: روش شناسی

 

3-1مواد شیمیایی.. 42

 

3-2 میكروارگانیسم ها ومحیط های كشت مورد استفاده 43

 

3-2-1 میكروارگانیسم ها و پلاسمیدها. 43

 

3-2-2محیط های كشت میكروبی.. 44

 

3-3 روش سنجش فعالیت پروتئاز. 45

 

العات اولیه آنزیم شناسی.. 46

 

3-4-1 اثر دما بر پایداری آنزیم.. 46

 

3-4-2 اثر pH بر پایداری آنزیم.. 46

 

3-4-3 دمای بهینه. 47

 

3-4-4 تعیین پارامترهای سینتیكی آنزیم.. 47

 

3-5 جداسازی باکتری.. 48

 

3-5-1 استخراج  DNAژنومی.. 48

 

3-5-2 طراحی پرایمر و انجام PCR… 48

 

 3-5-2-1 مراحل PCR ………..49

 

سازی ژن سراپپتیداز در وکتورT/A  . 50

 

3-5-4 رسم درخت فیلوژنتیک…. 51

 

3-5-5 تعیین توالی ژن کدکننده سراپپتیداز. 51

 

3-6 روشهای الکتروفورزی.. 53

 

3-6-1 SDS-PAGE.. 53

 

3-6-2 الکتروفورز ژل آگارز(100). 53

 

نوتركیب.. 54

 

3-7-1 ساختار ناقل كلونینگ…. 54

 

 

3-7-2 آماده سازی قطعهDNA  برای انتقال به درون وكتور. 55

 

3-7-3 استخراج DNA از روی ژل.. 56

 

3-7- 4 مراحل کلون مجدد. 56

 

3-7-5 مستعدکردن باکتری  DH5αبه روش استفاده از محلول CaCl2 (M 1/0). 58

 

3-7-6 انتقال محصول الحاق به درون باکتری مستعدDH5α . 59

 

3-8 بافرCracking. 60

 

3- 9بیان ژن سراپپتیداز و تعیین خلوص آن توسطSDS-PAGE 62

 

3-9-1 القاء باکتری و بیان پروتئین های نوترکیب… 62

 

3-9-2 بررسی بیان پروتئین های نوترکیب با استفاده از روش الکتروفورز. 63

 

3-10 تخلیص پروتئین های نوترکیب.. 66

 

نیاز تخلیص پروتئین نوترکیب… 66

 

3-10-2 روش تخلیص پروتئین نوترکیب… 67

 

فصل چهارم: تجزیه وتحلیل داده ها

 

4-1 جداسازی باکتری.. 70

 

DNAژنومی.. 70

 

4-3 رسم درخت فیلوژنتیکی.. 70

 

4-4 کلون کردن ژن سراپپتیداز در حامل بیانیpET28-a (+) 71

 

4-5 بیان و تخلیص ژن سراپپتیداز نوترکیب.. 75

 

4-6 منحنی استاندارد. 77

 

روی فعالیت آنزیم. 77

 

4-8 دمای بهینه آنزیم. 78

 

4 -9 بررسی خصوصویات کاتالیتیک آنزیم……79

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

 

5-1 نتیجه گیری نهایی.. 88

 

5-2 پیشنهادات.. 88

 

 منابع و مأخذ. 89

 

فهرست منابع انگلیسی….89

 

فهرست جداول

 

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

 

جدول 3-1 خصوصیات انواع سویه ها و پلاسمیدهای مورد استفاده در پژوهش …………………………………43

 

جدول 3-2 نسبت های واکنش الحاق …………………………………………………………………………………………..57

 

فهرست اشکال

 

عنوان                                                                                                          شماره صفحه

 

شکل 1-1 سیستم بیان pET ……………………………………………………………………………………………………….34

 

شکل 2-1 ناقل کلونینگPet28a…………………………………………………………………………………………………55

 

شکل 4-1 درخت فیلوژنتیکی رسم شده با استفاده از NCBI…………………………………………………………..71

 

شکل 4-2 الکتروفورز محصول واکنش PCR…………………………………………………………………………………72

 

شکل 4-3 الکتروفورز پلاسمید های استخراج شده از باکتریهای ترانسفورم شده توسط روش Cracking………………………………………………………………………………………………………………………………..73