1-4-1-1- آب مروارید هسته ای.. 13

 

1-4-1-2- آب مروارید پوسته ای.. 13

 

1-5- فرآیند توده ای شدن پروتئین های لنز و نقش آن در تشکیل آب مروارید. 14

 

1-6- فیبر آمیلوئید و ارتباط آن در تشکیل آب مروارید. 16

 

1-7- انواع تغییرات شیمایی پروتئین های کریستالین و نقش آن ها در بیماری آب مروارید. 17

 

1-7-1- قندی شدن غیر آنزیمی پروتئین آلفا-کریستالین.. 17

 

1-7-2- اکسایش پروتئین آلفا-کریستالین.. 18

 

1-7-3- دآمیناسیون، کوتاه شدگی و قطعه قطعه شدن پروتئین آلفا-کریستالین.. 19

 

1-7-4- هموسیستئینه شدن پروتئین آلفا-کریستالین.. 20

 

1-8- آنتی اکسیدان ها و پاک کننده های رادیکال آزاد لنز. 20

 

1-9- جریان یونی لنز و نقش آن در همئوستاز یونی.. 22

 

1-9-1- سدیم و پتاسیم.. 23

 

1-9-2- کلر. 24

 

1-9-3- روی.. 24

 

1-9-4- آهن.. 24

 

1-9-5- منیزیم.. 25

 

1-9-6- کلسیم.. 25

 

1-9-7- مس…. 27

 

1-9-8- سلنیم، سرب و کادمیم.. 28

 

1-10- 1- بیوشیمی پراکسی نیتریت به عنوان مولکول اکسایشگر طبیعی.. 29

 

1-10-2- پراکسی نیتریته شدن پروتئین ها  و آثار آن بر بدن.. 34

 

1-10-3- پراکسی نیتریت و بیماری های چشمی.. 40

 

1-11- پراکسی نیتریت و کلسیم.. 42

 

1-12-مس، اسید آسکوربیک و آب مروارید. 44

 

: مروری بر پژوهش های پیشین

 

مروری بر پژوهش های پیشین………………………………………………………………..45

 

اهداف پژوهشی…………………………………………………………………………………51

 

: مواد و روش ها

 

3-1-مواد مصرفی……………………………………………………………………………53

 

3-1-1- دستگاه ها……….…………………………………………………………………53

 

3-2- تهیه ی محلول ها …………….…………………………………………………….53

 

3-2-1-محلول برادفورد …….…………………………………….……………………….53

 

3-2-2-تهیه ی محلول های مورد نیاز روش الکتروفورز ژلی عمودی………………….55

 

3-2-2-1-تهیه ی محلول آکریل آمید و بیس آکریل آمید…………………………….55

 

3-2-2-2-تهیه ی محلول20 درصد SDS  ……………………………………….…….55

 

3-2-2-3-تهیه ی محلول 10 درصد آمونیوم پرسولفات………………………………..55

 

3-2-2-5-تهیه ی بافر تریس 5/0 مولار………………………………………………….56

 

3-2-2-4-تهیه ی محلول بافر تریس 5/1 مولار…………………………………………56

 

3-2-2-6-تهیه ی بافر تانک……………………………………………………………….56

 

3-2-2-7-تهیه ی بافر نمونه X2………………………………………………………….57

 

3-2-2-8-تهیه ی محلول رنگ‌آمیزی کوماسی بلو………………………………………57

 

 

3-2-2-9-تهیه ی محلول رنگ بر کوماسی بلو…….…………………………………….58

 

3-2-3-تهیه ی محلول های مورد نیاز سنجش گروه کربونیل………………………….58

 

3-2-3-1-تهیه ی محلول 4،2- دی نیترو فنیل هیدرازین…………………………….58

 

3-2-3-2-تهیه ی محلول اسید تری کلرو استیک (TCA) 20 درصد…………………59

 

3-2-3-3-تهیه ی محلول اتانول-اسید اتیل استیک (نسبت 1:1 ، حجمی)………….59

 

3-2-3-4-تهیه ی محلول گوانیدین هیدروکلراید 6 مولار………………………………59

 

3-2-4-تهیه ی محلول استوک ANS ………………………………………………………………………….60

 

3-2-5-تهیه ی محلول استوک تیوفلاوین-…………………………………………….T60

 

3-2-6-تهیه ی محلول استوک اسید آسکوربیک………………………………………..61

 

3-2-7-تهیه ی محلول های پروتئینی و تعیین غلظت آن ها……..…………………….62

 

3-2-7-1-تهیه ی محلول انسولین…….………………………………………………….63

 

3-3- تهیه ی محیط های کشت باکتری………………………………………………. 64

 

3-3-1- تهیه ی محیط کشت جامد………………………………………………………64

 

3-3-2- تهیه ی محیط کشت مایع……………………………………………………….65

 

3-4- روش ها……………………………………………………………………………….65

 

3-4-1- آماده سازی پروتئین های لنز چشم گاو………………………………………..65

 

3-4-2- بیان زیر واحد هایαA  و αB-کریستالین انسانی در سلول های BL21 ……. 66

 

3-4-3- تخلیص زیر واحدهایαA  و αB-کریستالین انسانی……………………………67

 

3-4-4- تعیین میزان خلوص پروتئین به روش SDS-PAGE …………….…..……… 69

 

3-4-5-فرآیند سنتز پراکسی نیتریت………………………………………………………69

 

3-4-6- فرآیند پراکسی نیتریته شدن پروتئین های محلول لنز چشم وαA  و αB-کریستالین انسانی….………………………………………………………………………..72

 

3-4-7-مطالعه ی هضم آنزیمی پروتئین های محلول لنز چشم طبیعی و تغییریافته با آنزیم آلفا-کیموتریپسین….…………………………………………………………………72

 

3-4-8-سنجش مقدار گروه های کربونیل پروتئین های محلول لنز چشم وαA  و αB-کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته……………………………………………………73

 

3-4-9- مطالعه فرآیند توده ای شدن پروتئین های کریستالین طبیعی و تغییر یافته در حضور یون کلسیم……………………………………………………………………………74

 

3-4-10- مطالعه ی فلورسانس پروتئین های محلول لنز چشم و αA-کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته…………………………………………………………………………74

 

3-4-10-1- مطالعه ی فلورسانس ذاتی………………………………………………….75

 

3-4-10-2- مطالعه ی فلورسانس عارضی ANS))……………………………………..76

 

3-4-10-3- مطالعه ی فلورسانس تیوفلاوین-………………………………………..T77

 

3-4-11- الکتروفورز ژلی پروتئین های محلول لنز چشم طبیعی و تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت در حضور یون کلسیم…………………………………………………77

 

3-4-12- مطالعه ی اثر محافظتیαA -کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته  بر اکسایش اسید آسکوربیک در حضور یون مس……………………………………………79

 

3-4-13- مطالعه ی فعالیت چاپرونی αA-کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته در حضور یون مس…………….………….………………………………………………………80

 

:  نتایج و بحث

 

بخش اول……………………………………………………………………………………………………………………82

 

4-1- مطالعه ی اثر پراکسی نیتریته شدن بر ساختار، ایجاد حالت الیگومری و توده ای شدن پروتئین های لنز چشم در حضور یون کلسیم…………………………………………………82

 

4-1-1-نقش پراکسی نیتریت و کلسیم در بیماری زایی عارضه ی آب مروارید……..83

 

4-1-2-مطالعه ی فرآیند پراکسی نیتریته شدن پروتئین های محلول لنز……………..85

 

4-1-2-1-سنجش تغییر حرکت ژل الکتروفورز پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت……………………………………………………………………………………………………..85

 

4-1-2-2-سنجش مقدار کربونیل پروتئین های لنز تغییریافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………………………………………..87

 

4-1-2-3- مطالعه ی فلورسانس ANS پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………………..89

 

4-1-2-4-مطالعه ی فلورسانس دی تیروزین پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………………..89

 

4-1-2-5-مطالعه ی اسپکتروسکوپی مرئی-فرابنفش پروتئین های کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………….90

 

4-1-3-مطالعه ی ناپایداری پروتئولیزی پروتئین های لنز  تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………………..90

 

4-1-4-مطالعه ی توده ای شدن پروتئین های طبیعی و تغییر یافته ی لنز به وسیله ی پراکسی نیتریت در حضور یون کلسیم………………………………………………………………….92

 

4-1-5-ارزیابی الیگومری شدن پروتئین های لنز طبیعی و تغییریافته در حضور یون کلسیم به وسیله ی الکتروفورز ژلی……………………………………………………………………………94

 

4-1-6-مطالعه ی فلورسانس عارضی پروتئین های طبیعی و تغییر یافته لنز در حضور یون کلسیم………………………………………………………………………………………………………………….99

 

4-1-7-مطالعه ی تشکیل فیبر آمیلوئیدی کریستالین های طبیعی و تغییر یافته در حضور یون کلسیم……………………………………………………………………………………………………101

 

بخش دوم…………………………………………………………………………………………………………………104

 

4-2- مطالعه ی ساختار و فعالیت چاپرونیαA -کریستالین های انسانی طبیعی و پراکسی نیتریته شده و بررسی نقش محافظتی آن ها در برابر اکسایش اسید آسکوربیک به وسیله ی یون های مس………………………………………………………………………………………104

 

4-2-1- بیان زیر واحد هایαA  و αB-کریستالین انسانی در سلول های BL21………………………………………………………………………………………………………………………105

 

4-2-2-تخلیص پروتئین هایαA  و αB-کریستالین انسانی…………………………………106

 

4-2-3- مطالعه ی فرآیند پراکسی نیتریته شدن پروتئینαA -کریستالین انسانی……………………………………………………………………………………………………………………….108

 

4-2-3-1- مطالعه ی الکتروفورز ژلی پروتئینαA -کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………………………..108