1-10- پری بیوتیک­ها……………………………………………. 14

 

1-11- باکتری­های بی­هوازی احیاکننده سولفات………………. 15

 

1-12- نقش باکتری­های احیا کننده سولفات در طبیعت……..15

 

1-13- نقش باکتری­های احیا کننده سولفات  در صنعت نفت….16

 

1-14- خوردگی میکروبی…………………………………….. 16

 

1-15- واکنش­های احیای ترموشیمیایی سولفات…………. 17

 

1-16-  سیستم­های آلوده به SRB…………………………..

 

1-17- اهداف، فرضیات و پرسش اصلی پژوهش…………….18

 

1-17-1 اهداف اصلی…………………………………………. 18

 

1-17-2 اهداف اختصاصی……………………………………. 18

 

1-17-3 اهداف کاربردی………………………………………. 18

 

1-17-4 فرضیات پژوهش……………………………………… 18

 

1-17-5 پرسش اصلی پژوهش……………………………… 18

 

فصل دوم: پیشینه پژوهش

 

2-1- پژوهش­های انجام گرفته در سطح جهان……………… 20

 

2-2- پژوهش­های انجام گرفته در ایران………………………. 23

 

فصل سوم: روش شناسی تحقیق

 

3-1- مواد و روش کار………………………………………….. 25

 

3-2- محیط کشت مورد نیاز………………………………….. 26

 

3-3- انتخاب بیماران مورد نظر برای نمونه ­برداری………….. 26

 

3-4- ارزیابی تاثیر آنتی بیوتیک ها برروی باکتری­های  SRB

 

3-4-1 آنتی بیوتیک کلیندامایسین………………………….. 30

 

3-4-2 آنتی بیوتیک جنتامایسین……………………………. 31

 

3-4-3 آنتی بیوتیک مترونیدازول………………………………. 31

 

3-5- ارزیابی خواص ضدمیکروبی آنتی بیوتیک­ها بر باکتری­های SRB مثبت…32

 

3-6- تعیین هویت مولکولی باکتری­های SRB مثبت………… 33

 

3-7- آنالیز آماری………………………………………………. 33

 

فصل چهارم: نتایج یافته های تحقیق

 

4-1- مقدمه…………………………………………………… 35

 

4-2- تجزیه و تحلیل نتایج جمعیت شناختی………………. 35

 

4-2-1 جنسیت……………………………………………….. 36

 

4-2-2 سن…………………………………………………….. 37

 

4-2-3 میزان تحصیلات……………………………………….. 38

 

4-2-4 میزان درآمد……………………………………………. 39

 

4-3- ارزیابی فرضیات پژوهش………………………………. 40

 

4-3-1 فرضیه اول………………………………………………40

 

4-3-2 فرضیه دوم……………………………………………. 43

 

4-3-3 فرضیه سوم………………………………………….. 45

 

4-3-4 فرضیه چهارم………………………………………… 47

 

4-3-5 فرضیه پنجم…………………………………………. 48

 

 

4-3-6 فرضیه ششم………………………………………. 50

 

4-4- نتایج آزمایش  PCR…………………………………..

 

4-4-1 تأیید استخراج DNA…………………………………

 

4-4-2 تأیید PCR ژن16S rRNA……………………………

 

4-4-3 توالی تعیین ترادف شده قطعه 16S rRNA……….

 

4-4-4 آنالیز فیلوژنتیکی……………………………………. 57

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

 

5-1- بحث……………………………………………………..63

 

5-2- نتیجه گیری……………………………………………. 67

 

5-3- پیشنهادات……………………………………………..67

 

منابع و مآخذ………………………………………………… 68

 

فهرست منابع فارسی……………………………………… 68

 

فهرست منابع انگلیسی…………………………………… 70

 

چکیده انگلیسی…………………………………………….. 73

 

چکیده:

 

باکتری­های احیا کننده سولفات (SRB) گروه بزرگی از میکروارگانیسم­های بی­هوازی هستند که نقش بسیار مهمی در بسیاری از فرآیندهای بیوژئوشیمیایی ایفا می­کنند. این پژوهش با هدف شناسایی وتعیین هویت مولکولی باکتری­های احیا کننده سولفات و نقش آن­ها در عفونت­های روده بزرگ و آپاندیسیت در شهر کرمان انجام شد. روش کار: این پژوهش به صورت مقطعی-توصیفی در سال 1391 تا 1392 بر روی 50 بیمار مراجعه کننده به بیمارستان­های مختلف شهر کرمان انجام شد. تمامی افراد مورد بررسی دارای مشکلات عفونت روده بزرگ ویا آپاندیسیت بودند. در بین این افراد نمونه­گیری از حفره شکم و روده ی بزرگ انجام شد. سپس نمونه­های تهیه شده به محیط کشت اختصاصی API تلقیح و 2 ماه در دمای 35 درجه سانتی گراد گرماگذاری شدند. سپس نمونه­های مثبت پس از کشت مجدد در محیط جامد اختصاصیSRB ، برای خالص سازی بیشتر به محیط جدید API  منتقل گردید. شناسایی مولکولی جدایه ها با استفاده از پرایمر یونیورسال  16s rRNA و مقاومت آنتی بیوتیکی صورت گرفت. از مجموع نمونه­های مورد پژوهش از6 مورد (12%) نمونه­های مشکوک به SRB جداسازی گردید. اما با روش مولکولی در4 مورد (8%) باکتری های احیا کننده سولفات شناسایی شد. بیشترین گونه ی باکتری­های (SRB) مربوط به سویه Desulfovibrio piger بود. همچنین بین جداسازی باکتری­های SRB، سن و میزان تحصیلات افراد ارتباط معنی­داری مشاهده شد مناسب­ترین آنتی­بیوتیک برای حذف باکتری­های SRB کلیندامایسین شناسایی شد. با توجه به نقش احتمالی باکتری­های SRB در  ایجاد سرطان کلون و عفونت­های روده­ای، ضرورت انجام پژوهش­های تکمیلی و پایش مداوم بالینی در جمعیت­های گسترده تر و ارزیابی نقش بیوسایدها وآنتی­بیوتیک­ها در حذف این باکتری­ها وجود دارد.

 

مقدمه:

 

باکتری­های احیا کننده سولفات SRB به طور وسیعی در اقیانوس، آب­های شیرین، لجن­ها پراکنده­اند. این باکتری­ها از سولفات به عنوان پذیرنده نهایی الکترون استفاده و سولفید هیدروژن تولید می­نمایند. تا اکنون 14 جنس از این گروه باکتری­ها شناخته شده که به جز دسولفونما ویبرو تمامی آن­ها گرم منفی می­باشند. یک جنس از این باکتری­ها به نام دسولفوویبرو می­تواند در هنگام تکثیر فعال خود بیش از 10 گرم در لیتر سولفید هیدروژن تولید نماید (آبیارد 1382، 12-11؛ ;Geneva 2001, 157 Collette 1999, 198 ).

 

باکتری­های SRB نقش مهمی را در شروع التهاب یا التهاب­های دائمی از قبیل بیماری­های دندان[1] ایفا     می­کنند (;Langendijk 2000, 943-950 loubinoux et al 2003, 1304-1306 ). Desulphovibrio spp از آبسه­های شکمی و آبسه­های مغزی و همچنین از خون و ادرار نیز جدا شده­اند (Collette 1999, 198). باکتری­های SRB انرژی مورد نیاز خود را از احیای سولفات بدست می­آورند این باکتری­ها به دلیل تولیدH2s  که بجز ترکیبات سیتوتونیک[2] مهم است و یک عامل خورنده[3] می­باشد (Barton 2007, 1-523) و در مجاری دستگاه گوارش (دهان و روده) انسان و حیوانات وجود دارند. یکی از آرکی متانوژنیک (متانوژن) به نام متانو بروی باکتراسمیتی[4] در عفونت­های انسانی یافت شده است (Worden and Smelly 1996, 157-171 ) مهم ترین باکتری­های احیاکننده سولفات شناسایی شده در فلور روده عبارتند از:

 

دسولفوتوماکولوم[5]، دسولفوویبریو[6]، دسولفوبولبوس[7]، دسولفوفیرفیلدنیس[8]، دسولفوویبریوپیگر[9] (Goldstein 2003, 2752-2754؛ La Scola and Raoult 1999, 3076-3077 ، Susceptibilities of  23 Desulfovibrio Isolates from Humans, 5308–5311 ).

 

براساس مطالعات Birvin در سال 2001 در کشور کانادا شیوع مشکلات گوارشی همراه با درد 6% گزارش کرد و در سال 2003 Ehlin و در سال 2004 Wilson در انگلستان شیوع عفونت را به ترتیب 2/8 درصد و 5/10 درصد گزارش کردند که از سال 1970 تا 2004 به طرز چشمگیری افزایش پیدا کرده است. Hugin در سال 2005 و Boivin در سال 2001 در ایالات متحده امریکا عفونت روده در بین دانش آموزان و در محدوده سنی بین 16 تا 30 سال در مردان 65 درصد و در زنان 44 درصد گزارش کردند.

 

در سال 1992، John، Boseph و همکاران ثابت کردند که منوباکتام­ها (آزترونام) یا آمینوگلیکوزیدها به همراه کلیندامایسین یا مترونیدازول در کاهش (Intra abdominal infections) موثر می­باشند (Yoshiota et al 1991, 11-17 ).

 

آنتی­بیوتیک کلیندامایسین از دسته داروهای پادباکتری با نیمه عمر 2 تا 3 ساعت مانع از بیوسنتزپروتئین توسط باکتری می­شود که در درمان پریتونیت، عفونت­های داخل شکمی و همچنین عفونت­های استافیلوکوکی مصرف می­شود. مترونیدازول یکی از داروهای نیتروایمیدازول اثر کشندگی بر باکتری­های  بی­هوازی و پروتوزوآها دارد از این رو در درمان بیماری­های التهابی، کولیت پسودو ممبراند و عفونت­های ژیادریایی مصرف می­شود (منصور 1390، 36-35؛ گوهرخانی 1374، 27؛ سیمون 1368، 18-17).

 

هدف از این پژوهش، ارزیابی نفش باکتری­های احیا کننده سولفات در ایجاد عفونت­های روده بزرگ و آپاندیسیت در شهر کرمان می باشد.

 

1-1- مورفولوژی روده بزرگ

 

روده بزرگ به طول 1.4 تا 1.8 متر، از انتهای روده باریک شروع شده و به مجرای مقعد ختم می­شود. ابتدای روده­ی بزرگ که در ارتباط با ایلئوم قراردارد، سکوم یا روده کور نامیده می­شود. قسمتی ازروده بزرگ که بین سکوم وآنال کانال قراردارد، کولون نامیده می­شود که به سه قسمت کولون مساعد، کولون افقی وکولون نازل، تقسیم می­گردد. کولون نازل درانت ها به سیگموئیدورکتوم و نهایتاً آنال کانال، ختم می­شود (جان ای 1389، 90-89).

 

1-1-1- سکوم و آپاندیس

 

سکوم قسمت ابتدایی روده بزرگ است که زاییده آپاندیس به قسمت بن بست آن متصل می­شود. آپاندیس زایده­ی انگشت مانندی است به طول 10-5 سانتی­متر وقطر متوسط 8/0 سانتیمتر که با افزایش سن قطر آن کاهش می­یابد. دیواره آپاندیس مرکب از 4 لایه­ای است که درسایر قسمت­های لوله گوارش یافت می­شود. مخاط آپاندیس شبیه روده بزرگ، فاقد پرز وچین و حاوی غدد لوله­ای مستقیم است. اپیتلیوم پوشاننده آن شامل سلول­ های جذب­کننده و جامی است. آستروزیر مخاط حاوی تعداد زیادی عقده­های لنفاوی است که با افزایش سن ازتعداد آنها کاسته می­شود. در افراد سالخورده با ناپدیدشدن بافت لنفاوی درآپاندیس، مخاط وزیرمخاط فیبروزه میشوند. طبقه عضلانی در آپاندیس شبیه روده کوچک، مرکب از عضلات حلقوی درداخل وعضلات طولی درخارج است که از خارج بوسیله بافت سروز پوشیده شده است. آپاندیس یک عضو لنفاوی است و مانند دیگربافت­های لنفاوی میتواند ملتهب شده وتولید آپاندیسیت نماید (جان ای 1389، 90-89).

 

2-1-1- کلون

 

وظیفه اصلی کلون جذب آب واملاح است که در نتیجه آن مواد هضم نشده وارده از روده باریک به کلون، از حالت مایع به حالت جامد درآمده و مدفوع[1] نامیده می­شود. باتوجه به عملکرد روده بزرگ که در اصل هدایت مواد هضم نشده به خارج از بدن است، روده بزرگ فاقد چین و پرز است.

 

کلون شامل قسمت­های کلون صعودی، کلون عرضی، کولون نزولی، کلون خاصره لگنی یا سیگموئید روده مستقیم دنباله کلون خاصره لگنی و قسمت انتهایی روده کلفت است. طول آن 12 تا15 سانتیمتر میباشد. قسمت تحتانی روده مستقیم به مجرای مقعدی[2] ختم می­شود. رگ­های خونی تغذیه کننده روده با عبور از طبقه عضلانی به زیر مخاط رسیده و شبکه عروق بزرگی را بوجود می آورند که انشعابات آن به آستر محور پرزهای در روده باریک، نفوذ می­نماید. شریانچه­های انتهایی، پس از تشکیل شبکه مویرگی در درون پرزها به وریدچه­ها منتهی می­شوند. عروق لنفی روده به صورت بن بست از راس پرزها شروع و مجرای شیری نامیده می­شوند. این رگ­ها شبکه مخاطی را تشکیل داده وسپس به لنفاتیک­های زیر مخاط می­ریزند.     رگ­های لنفی زیرمخاطی، پس ازعبور از عقده های لنفی مسیر، توسط مجرای توراسیک به سیستم وریدی تخلیه می­شوند. بنابراین مواد حمل شده از طریق رگ­های لنفی وارد کبد نمی­شوند. عصب­گیری لوله گوارش توسط سیستم عصبی اتونوم انجام می­گیرد که خود به دو قسمت داخلی[3] و خارجی[4] تقسیم  می­گردد. قسمت داخلی که به سیستم عصبی روده­ای نیز موسوم است، مرکب از  نورون­های حسی،    نورون­های رابط و نورون­های حرکتی است که بدون ارتباط با سیستم عصبی مرکزی وبه طور رفلکس، عمل می­نماید. بدین ترتیب که تحریکات ناشی از ترکیب مواد غذایی (تحریکات شیمیایی) یا اتساع روده در اثر تجمع مواد (اتساع مکانیکی) به شبکه­های مایسنر، منتقل شده و نورون­های حرکت آنها، سبب ترشح   سلول­های اپیتلیال، انقباض عضلات وتحریک حرکات روده می­شوند (حسن پور 1389، 77-76؛ سوزان 1389، 24-23؛ ساداتی 1389، 57-56).

 

2-1- بیماری­های روده بزرگ

 

1-2-1- آپاندیسیت

 

بیماری آپاندیسیت یا التهاب زایده کرمی شکل شیوع فراوان دارد. علل پیدایش آپاندیسیت بسیار مختلف است. یبوست، انگل­های روده، تورم روده بزرگ، عفونت­های عمومی ازقبیل گریپ، آنژین چرکی میتوانند ایجاد آپاندیسیت نمایند. اولین علامت مهم آپاندیسیت حاد، احساس درد در اطراف ناف است، اما هنگام لمس و فشار ناحیه راست و زیرشکم، دردناک است. هنگام حمله درد آپاندیسیت، جدار سمت راست وزیرشکم سخت می شود.

 

بیمار حالت تهوع واستفراغ دارد. تب مختصر است و آزمایش خون ازنظر نوع گلبول­های سفید، عفونت حاد را نشان می دهد. اگر آپاندیس بیمار برداشته نشود، حمله حاد آپاندیسیت گاه به گاه تکرار خواهد شد. علت عود بیماری اغلب یک سرماخوردگی است. حملات بعدی آپاندیسیت همیشه سختتر بوده و با عوارض بیشتری توام است. آپاندیس متورم ممکن است در مدت کوتاهی چرک کند و قانقاریا شود.

 

2-2-1- عفونت های داخل شکمی

 

معمولاً توسط مخلوطی از باسیل­های روده­ای گرم منفی وباکتری­های بی­هوازی، ایجاد می­شوند. این مخلوط ارگانیسم­ها باعث ظرفیت پتانسیل بیماری­زایی باکتری­ها می­شود (دیناکی 1389، 151).

 

عفونت­های داخل شکمی شامل عفونت های حفره صفاق یا فضای پشت صفاقی است. حفره صفاق از زیر سطح دیافراگم تا کف لگن گسترده است و دربرگیرنده معده، روده کوچک، روده بزرگ، کبد، کیسه صفرا و طحال است. عفونت­های داخل شکمی گاهی پراکنده یا موضعی هستند و این عفونت­ها شاید داخل ساختمان­های احشایی مثل کبد، کیسه صفرا، طحال، لوزالمعده، کلیه یا اندام­ها تولید مثلی خانم ها بروز کنند.

 

 

1-13-4 تاریخچه فیلوژنی سرده Viola…………………………………..

 

1- 14 اهداف……………………………………………………………….. 39

 

فصل دوم: مواد و روش ها

 

2-1 مطالعات تشریحی……………………………………………………. 41

 

2-1-1 روش تهیه محلول های رنگ آمیزی……………………………….. 42

 

2-2 بررسی مورفومتری و آنالیز عددی…………………………………… 44

 

2-2-1 نمونه برداری………………………………………………………… 44

 

2-2-2 اندازه گیری و آنالیز………………………………………………….. 45

 

2-3 مطالعه ی فیلوژنی مولکولی در گونه های Viola…………………..

 

2-3-1 استخراج DNA ژنومی از گیاه با استفاده از روش CTAB………..

 

2-3-1-1 روش تهیه بافر CTAB……………………………………………

 

2- 3 – 1 -2  تعیین غلظت و خلوص DNA……………………………….

 

2- 4  تکثیر قطعات DNA مورد نظر……………………………………….. 52

 

2- 4- 1 آغازگر ها………………………………………………………….. 52

 

2- 4- 2 دستورالعمل واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)………………… 52

 

2-4-3 برنامه واکنش PCR برای تکثیر قطعات  DNA مورد مطالعه……… 53

 

2-4-4 الكتروفورز ژل آگارز………………………………………………….. 53

 

2-4-5 تخلیص PCR………………………………………………………….

 

2-4-5-1 تخلیص محصول PCR……………………………………………..

 

2-4-5-2 تخلیص محصول PCR  از ژل……………………………………… 55

 

2- 4-6  تعیین توالی قطعات تکثیر یافته و آنالیز آنها……………………. 56

 

2-4-7 آنالیز فیلوژنتیکی……………………………………………………. 57

 

2-4-7-2 روش بیشینه صرفه جویی………………………………………. 58

 

2- 4- 7-3  روش بیشینه احتمال………………………………………….. 58

 

2- 4-7- 5 مقایسه دو روش آنالیزی MP  و ML…………………………..

 

2- 4-7- 6 نحوه ی ترکیب دو مجموعه اطلاعاتی trnL-F و ITS………..

 

فصل سوم: نتایج

 

3-1 کلید شناسایی گونه های Viola در شمال ایران…………………. 62

 

3-2 شرح گونه های بخشه Viola……………………………………….

 

3-3 مطالعات تشریحی…………………………………………………… 82

 

3-4 آنالیز عددی……………………………………………………………. 98

 

3-4-1 زیربخشه Viola……………………………………………………..

 

3-4-2 زیربخشه Rostratae………………………………………………

 

3-5 مطالعات ملکولی…………………………………………………….. 103

 

3-5-2 تعیین توالی قطعه تکثیر یافته…………………………………….. 105

 

3-5-3 آنالیز فیلوژنتیکی توالی ITS……………………………………….

 

3-5-3-1  آنالیزماکسیمم پارسیمونی داده های مولکولی nrDNA ITS……….

 

3-5-3-2 آنالیزماکسیمم پارسیمونی داده های trnL-F cpDNA……..

 

3-5-3-3  آنالیز Maximum Liklihood داده های nrDNA ITS…………

 

3-5-3-4 آنالیز Maximum Liklihood داده های trnL-F cpDNA………

 

 

3-5-3-5 آنالیزماکسیمم پارسیمونی داده های ترکیبی nrDNA ITS  وcpDNA trnL-F

 

3-5-3-6 آنالیز Maximum Liklihood داده های ترکیبی nrDNA ITS  وcpDNA trnL-F

 

فصل چهارم: بحث

 

4-1 مطالعات تاکسونومیکی…………………………………………. 124

 

4-2 مطالعات آناتومی…………………………………………………. 127

 

4-3 تاکسونومی عددی……………………………………………….. 129

 

4-4 مطالعات ملکولی…………………………………………………. 130

 

4-5 پیشنهادات………………………………………………………… 134

 

فصل پنجم: منابع

 

منابع…………………………………………………………………….. 136

 

چکیده:

 

در این مطالعه، بررسی بیوسیستماتیکی بخشه Viola از سرده Viola در شمال ایران از جنبه های مرفولوژیکی، آناتومیکی و ملکولی انجام شد. آنالیز عددی برای تاکسونهای جمع آوری شده از ایران متعلق به دو زیربخشه Viola و Rostratae به صورت جداگانه انجام گرفت و بر اساس نتایج حاصل از این آنالیز، گونه های هر کدام از زیربخشه های Viola و Rostratae از یکدیگر متمایز شدند. به منظور انجام مطالعات آناتومیکی، بخش های ریشه، ساقه رونده، برگ، دمبرگ و دمگل مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که صفات مورد بررسی در تمایز زیربخشه ها و گونه ها  مفید هستند. بر این اساس دو گونه V. alba ssp. alba و V. sintenisii، در برشهای ریشه در وجود یا عدم وجود ناحیه مغز و تعداد لایه های پارانشیمی زیر آوند چوب از یکدیگر متمایز گردیدند. دو گونه نزدیک V. caspia و V. reichenbachiana نیز در برش های ریشه، در وجود یا عدم وجود مغز و تراکم کریستالی از یکدیگر قابل تمایز بودند. در بررسی مولکولی، از دو نشانگر، شامل nrDNA ITS و cpDNA trnL-F برای تعیین حدود گونه ها استفاده شد. بر این اساس، گونه های این بخشه به خوبی از یکدیگر متمایز شدند. به منظور بازسازی روابط فیلوژنی بخشه Viola و بررسی میزان خویشاوندی این بخشه با سایر بخشه های سرده Viola، داده های مولکولی با استفاده از روش بیشینه صرفه جویی تعبیه شده در نرم افزار PAUP* 4.b10 و روش بیشینه احتمال در نرم افزار TreeFinder (Version Of March 2011) آنالیز شدند. درخت مطلق مرکزی با بیشترین پارسیمونی برای داده های ترکیبی ITS و trnL-F، یک کلاد با ارزش حمایتی 100% را برای بخشه Viola بادو زیر بخشه Viola و  Rostratae نشان می دهد. نتایج حاصل از این مطالعه، حضور 6 گونه و 3 زیر گونه را تایید کرده است. نتایـج به دست آمده نشان داد که V. alba ssp. alba و V. sintenisii به صورت سیمپاتریک در شمال ایران پراکنش دارد.

 

مقدمه:

 

1-1- تاریخچه مطالعات سیستماتیکی سرده Viola 

 

سرده .Viola L. با دارا بودن 600-525 گونه همـی کریپتوفیت[1]، کامـوفیت[2] و فانـروفیت[3] بزرگتـرین سـرده خانـواده Violaceae اسـت Clausen, 1964; Ballard, 1996)). ایـن سـرده در سـال 1753 توسـط لینــه[4] معـرفی شد و نمـونه تیپ  این سـرده، V. odorata است که در سال 1982 نمونه لکتوتیپ آن توسط Haesler جمع آوری و گزارش شد (Marcussen, 1998).

 

این سرده در سال 1823 توسط گیاهشناس سوئیسی De Candolle به بخشه ها و زیر بخشه های مختلف طبقه بندی شد (Chatterjee & Sharma, 1987). در سده گذشته، مونوگرافر آلمانی، Becker، اولین  تاکسونومیستی بود که این سرده را در سطح جهان بررسی کرد و تعداد بسیار زیادی گونه جدیـد و تقسیم بندیهای تاکسونومیکـی جدیدی معرفی کرد (Becker, 1916, 1917a, 1917b, 1918, 1922, 1923a, 1923b, 1923c, 1923d, 1924, 1925a). مطالعات وی در ایـن زمینـه (1925b)، اولیـن ارزیابـی جامـع سرده Viola را شامـل شناسـایی 14 بخشه و تقـریباً دو برابر گروه های زیر بخشـه ای در جهـان، بوجـود آورد، بزرگتـرین بخشـه آن Nomimium بود که بعدها به نام بخشـه Viola تغییـر پیـدا کرد. سپس Clausen (1927, 1929, 1964) بازبینی های تاکسونومیکی عمده ای بر طبقه بندی Becker انجام داد که اغلب آنها توسط متخصصان بعدی پذیرفته شد، در حالیکه قسمتی هنوز مبهم باقی مانده است. متخصصان دیگر تغییرات دیگری اعمال کردند که عمدتاً شامل نامگذاری های اولیه بود (Bamford & Gershoy, 1930; Gershoy, 1934; Yuzepchuk & Klokov, 1974). Clausen گروه های بدون ساقه اصلی با عدد کروموزومی پایه x=12 یا مشتقات آنیوپلوئیدی را در بخشه Plagiostigma قرار داد و گروه های با عدد پایه کروموزومی x=10 را در بخشه Nomimium (بخشه نامعتبر Rostellatae در طبقه بندی خودش) قرار داد که اکنون به میزان زیادی کاهش پیدا کرده است. وی همچنین گروه هایی که به طور برجسته دارای ساقه اصلی و گلهای زرد بودند را از سری ها و زیربخشه ها به بخشه Chamaemelanium ارتقاء داد و بخشه Nuttallianae را به تعدادی زیر بخشه تقسیم کرد. اگرچه برخی متخصصان بخشه Dischidium در طبقه بندی Becker را حفظ کردند و زیر بخشه Orbiculares را در بخشه Nomimium ابقا کردند، Clausen بخشه Dischidium و Orbiculares را ادغام کرد و آنها را در بخشه Chamaemelanium، زیر بخشه Beflorae که به صورت نامعتبر چاپ شده بود، قرار داد. Clausen و دیگر متخصصان عقاید متفاوتی درباره محدوده و مرتبه گروه های Adnatae، Diffusae، Langsdorffianae، Stolonosae و Vaginate ابراز کرده اند (Ballard et al., 1999).

 

تصویری از خلاصه طبقه بندی Becker و تغییرات عمده اعمال شده توسط محققین بعدی در شکـل 1-1-1 نشان داده شده است.

 

2-1- موقعیت سیستماتیکی تیره Violaceae 

 

تیره Violaceae Batsch. با 23 جنس و نزدیک به 900-825 گونه عموماً در نواحی گرمسیری و نیمه گرمسیری جهان پراکنش دارد (Munzinger & Ballard, 2003; Melchior, 1925; Valentine, 1962; Watson & Dallwitz, 1992-97; Kruse, 1994). این تیره به مدت طولانی به عنوان تیره اصلی[1] راسته Violales شناخته می شد (Cronquist, 1981; Takhtajan, 1997)، ولی بر اساس مطالعات ملکولی در راسته Malpighiales قرار گرفته است (APG II, 2003; APGIII, 2009). دراین راستـه، تیـره Violaceae و 4 تیـره دیگـر (Achariaceae, Lacistemataceae, Passifloraceae & Salicaceae) یک کلاد را تشکیل می دهند (Davis et al., 2005; Tokuoka & Tobe, 2006) و Violaceae به عنوان گروه خواهری با Passifloraceae در نظر گرفته می شود (Soltis et al., 2007; Tokuoka & Tobe, 2006).

 

طبقه بندی تیره Violaceae توسط چندین گیاه شناس بررسی شده است (Melchior, 1925; Hekking, 1988; Munzinger & Ballard, 2003). با توجه به اغلب سیستم های طبقه بندی اخیر، این تیره به 3 زیر تیره تقسیم می شود: Leonioideae و Fusispermoideae از آمریکای جنوبی، که هر دو مونوژنریک و به طور مشخص ابتدایی هستند (Hodges et al., 1995; Hekking, 1988) و Violoideae که اشتقاق بیشتری دارد و بقیه سرده را شامل می شود. این طبقه بندی بر اساس پیچش گل در غنچه[2]، میوه، نوع بذر و میزان اتصال سطح پشتی بساک ها بوده است (Hekking, 1988; Munzinger & Ballard, 2003). زیر تیره Violoideae بر اساس دو صفت جام گل منظم یا نامنظم و حضور یا عدم حضور شهدگاه[3] به 2 طایفه Violeae و Rinoreae تقسیم می شود (Hekking, 1988; Munzinger & Ballard, 2003)، که سرده Viola متعلق به طایفه Violeae می باشد.

 

3-1- موقعیت سیستماتیکی سرده Viola

 

سرده Viola  بر اساس سیستم APG III طبق سلسله مراتب طبقه بندی زیر قرار می گیرد (APG III, 2009)

 

گونه های Viola در ایران بر اساس فلور ایران، در دو بخشه قرار می گیرند: بخشه Viola با 14 گونه و بخشه Melanium  با 5 گونه (خاتم ساز، 1991). این تقسیم بندی در فلورا ایرانیکا به این صورت است:

 

بخشه Viola با 9 گونه، بخشه Melanium با 4 گونه و بخشه Sclerosium با 2 گونه.

 

4-1- شرح ریخت شناسی تیره Violaceae

 

گیـاهانی علفی، درختچـه ای یا درختـی؛ کرک ها اغلب ساده؛ برگ ها متنـاوب یا متقابل، گاهی تشکـیل رزت انتهایی می دهند؛ ساده یا گاهی لوبدار، با حاشیه کامل یا اره ای و رگبندی شانه ای یا پنجه ای؛ دارای گوشوارک. گل آذین اغلب کاهش یافته به صورت یک گل منفرد، معمولاً محوری؛ گل ها اغلب دوجنسی؛ کاسبرگ ها 5 عدد، جدا از هم، گلبرگ ها 5 عدد، جدا از هم، با آرایش متراکب [1]یا حلقوی[2]، گلبرگ پایینی گاهی مهمیز دار. پرچم ها معمولاً 5 عدد، کنار یکدیگر به صورت یک حلقه به دور مادگی قرار گرفته اند، میله بسیار کوتاه، جدا از هم تا کمی پیوسته، دو بساک پشتی یا همه بساک ها با شهدگاه مهمیزی یا غده ای شکل، اغلب به یک زایده رأسی سه گوش یا غشایی متصل شده؛ دانه های گرده اغلب Tricolporate؛ برچه ها معمولاً 3 عدد، متصل؛ تخمدان فوقانی، با تمکن جانبی؛ خامه معمولاً خمیده یا نوک دار، کلاله معمولاً پهن شده، گاهی لوبدار. تخمک ها یک عدد یا بیشتر در هر تمکن؛ میوه معمولاً کپسول چند خانه ای؛ بذر ها معمولاً دارای زایده آریل.

 

5-1- شرح ریخت شناسی سردهViola

 

ریخت شناسی گل

 

 سرده Viola بر اساس ریخت شناسی گل به دو دسته تقسیم می شود (Tutin et al., 1968): بخشه Melanium که Pansies نامیده می شوند و سایر بخشه ها که با نام عمومی Violets شناخته می شوند. وجه تمایز دو گروه نحوه قرارگیری گلبرگ های کناری است که در Violets به سمت پایین و در Pansies به سمت بالا است. ویژگی های متمایز کننده دیگر عبارتند از: (i) پراکنش بیوجغرافیایی: Pansies تنها در اروپا و غرب آسیا پراکنش دارد، درحالیکه Violets همه جا زی[1] هستند (Clausen, 1929). (ii) وجود چند شکلی[2] دانه گرده: بررسی 28 گونه اروپایی Viola نشان می دهد که 81% گونه های Pansies این چند شکلی را نشان می دهند در صورتی که این رقم برای Violets 42% است (Dajoz, 1999)؛ (iii) دیگر ویژگی های ریخت شناسی گل مانند طول جام گل و طول مهمیز؛ همچنین اکولوژی گرده افشانی در بین دو گروه به میزان زیادی متفاوت است (Beattie, 1971, 1974; Herrera, 1993; Ballard, 1996). Pansies تنها گل های برون زاد آور (Chasmogamous) تولید می کننـد (Knuth, 1908; Herrera, 1993)، در حالیکه Violets هر دو نوع گل های باز و جاذب حشرات (Chasmogamous) و گل های شدیداً کاهش یافته، بسته و خود گرده افشان (Cleistogamous) تولید می کنند (Beattie, 1969; Grime et al., 1986).

 

فرم رویشی: در سرده Viola، فرم رویشی به میزان قابل توجهی در بین گونه ها متفاوت است. ساختار پایه غالب در این سرده، ریزوم با برگ های رزت انتهایی (در چند ردیف)، چند ساله و ساقه گل دهنده جانبی (با برگ هایی در دو ردیف)، یک ساله است. این ساختار پایه برای مثال در V. riviniana و V. rupestris، به شکل های مختلف تغییر می یابد. در برخی گونه ها، برگ های رزت وجود نداشته و تنها ساقه گل دهنده خارج شده از ریزوم دیده می شود (V. elatior, V. canina). در برخی دیگر، ساقه هوایی به صورت ساقه رونده[3] تغییر یافته (V. palustris, V. odorata) و یا اصلاًً وجود ندارد (V. hirta, V. somchetica). در بخشه Melanium سیستم ساقه ای اصلی به میزان زیادی تغییر یافته و به آسانی قابل شناسایی نیست. گونه های درختی و درختچه ای در هاوایی دیده می شود (V. tracheliifolia, V. waialenalenae).  به گونه هایی که گل های آن در ساقه های هوایی قرار دارد، ساقه دار[4]  و به آن دسته که گل ها از محل خروج  برگ های رزت ایجاد می شوند، بدون ساقه[5] می گویند.

 

برگ: برگ ها ساده، رزت و یا ساقه ای با آرایش متناوب؛ معمولاً قلبی شکل، کلیوی شکل تا سه گوش، گاهی کشیده یا تخم مرغی و یا  قاشقی؛ حاشیه کامل، دندانه دار یا اره ای؛ دمبرگ دار.

 

کرک:  در صورت وجود ساده، با اندازه متغیر در بین گونه ها، به صورت پراکنده تا متراکم یا پشم آلود.

 

گوشوارک: ساده یا لوبدار تا منقسم و برگی شکل؛ حاشیه ساده، دندانه دار یا شرابه ای تا مژه دار.

 

گل آذین: به صورت گل منفرد دیده می شود که به صورت محوری روی ساقه گل دهنده قرار می گیرد و یا از رزت و یا ساقه رونده تشکیل می شود.

 

گل ها: دو جنسی؛ ریزان؛ نامنظم؛ دارای مهمیز؛ بنفش تا آبی، گاهی سفید یا زرد یا ترکیبی از اینها.

 

اجزاء گل:

 

گلبرگ: نامنظم؛ 5 عدد؛ جدا از هم؛ واژ تخم مرغی یا گرد؛ هم اندازه، بزرگتر یا کوچکتر از کاسبرگها؛ دو گلبرک کناری به سمت بالا (بخشه Melanium) و یا پایین (سایر بخشه ها)؛ گلبرگ پایینی مهمیز دار، گاهی رنگی یا مخطط (جاذب گرده افشان ها).

 

کاسبرگ: پایا؛ نامنظم؛ 5 عدد، جدا از هم؛ تخم مرغی، نیزه ای یا سه گوش؛ حاشیه ساده یا مژه دار.

 

پرچـم: 5 عدد، جدا از هم، فاقـد میـله، در رأس به زایـده غشایـی سه گوش متصـل است و به صورت حلقـه ای دور مادگـی را فرا مـی گیرد. دو بساک به همدیگر چسبیده است و هر کدام با یک شکاف باز می شود. دو پرچم پایینی زایده دار است که به درون مهمیز کشیده می شود.

 

 

1-6- مقایسه جنین­های طبیعی با جنین­های آزمایشگاهی……………………………………….26

 

1-7- انجماد

 

1-7-1- مراحل اصلی انجماد…………………………………………………………………………30

 

1-7-2- راه­های کاهش اثرات زیانبار مواد محافظت کننده…………………………………………30

 

1-7-3- روش­های انجماد……………………………………………………………………………….30

 

1-7-3-1- انجماد شیشه­ای…………………………………………………………………………..31

 

1-7-3-1-1- عوامل تکنیکی موثر در انجماد شیشه­ای……………………………………………..32

 

1-7-3-1-1-1- زمان تعادل و آبگیری……………………………………………………………………32

 

1-7-3-1-1-2- سرعت سرد کردن………………………………………………………………………32

 

1-7-3-1-1-3- سرعت گرم کردن……………………………………………………………………….35

 

1-7-3-1-1-4- مواد محافظ انجمادی……………………………………………………………………35

 

1-7-3-1-1-5- نقش ضد یخ­ها…………………………………………………………………………..36

 

1-7-3-1-1-6- ذوب و آبدهی…………………………………………………………………………. 36

 

1-8- آلدوسترون………………………………………………………………………………………….37

 

1-8-1- خصوصیات………………………………………………………………………………………37

 

1-8-2- عملکرد………………………………………………………………………………………….38

 

1-9- ارزیابی کیفیت رویان……………………………………………………………………………..41

 

1-10- سلول­های رویانی………………………………………………………………………………..43

 

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

 

2-1- اثرات انجماد بر روی تخمک………………………………………………………………………46

 

2-2- اثر روش انجماد شیشه­ای……………………………………………………………………….47

 

2-3- بیان زیر واحد­های پمپ Na/K ATpase در تخمک و جنین……………………………………..48

 

2-4- پمپ  Na/K ATpase ……………………………………………………………………………

 

2-5- آکواپورین­ها…………………………………………………………………………………………..51

 

2-6- هچ یا تفریخ………………………………………………………………………………………..52

 

2-7- فعال شدن ژنوم رویانی……………………………………………………………………………55

 

2-8- متابولیسم رویان…………………………………………………………………………………..56

 

2-9- نقش آلدوسترون در بیان پروتیین Na/K ATpase………………………………………………

 

فصل سوم: مواد و روش­ها

 

3-1- تولید جنین های حاصل از لقاح خارج رحمی (IVF)

 

3-1-1- جمع‌آوری تخمدان‌ها از کشتارگاه و استحصال تخمک‌ها از مایع فولیکولی……………….61

 

3-1-2- بلوغ آزمایشگاهی تخمک‌ها (IVM)………………..……….…….………………………………62

 

3-1-3- لقاح داخل آزمایشگاهی (IVF)…………………………………………………………………63

 

3-1-3-1- آماده سازی اووسیت­های بالغ شده برای لقاح………………………………………………63

 

3-1-3-2- آماده سازی اسپرم…………………………………………………………………………….63

 

3-1-4- کشت داخل آزمایشگاهی جنین های حاصل از(IVF)………………………………………..64

 

3-1-5- تازه كردن محیط کشت جنین‌ها…………………………………………………………………65

 

3-2- تهیه محلول‌های انجمادی…………………………………………………………………………..65

 

3-3- مراحل انجام روند انجماد شیشه ای………………………………………………………………66

 

3-4- محیط ذوب…………………………………………………………………………………………….66

 

 

3-5- گروه­های آزمایشی و طراحی مطالعه…………………………………………………………….66

 

3-6- ارزیابی جنین‌ها

 

3-6-1- ارزیابی کیفی جنین‌ها با استفاده از رنگ‌آمیزی افتراقی……………………………………..68

 

3-7- ایمونوسایتوشیمی پروتئین­های سطحی جنین های گوسفندی(Sheep embryo ICC)……..70

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1- تخمک­های منجمد شده

 

4-1-1- گروه آزمایشی اول، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمک­های منجمد-ذوب شده در مرحله GV

 

4-1-2- گروه آزمایشی دوم، افزودن آلدوسترون در روز چهارم

 

جنینی (D4)، به محیط کشت جنین­های حاصل از تخمک­های منجمد-ذوب شده…………………..82

 

4-1-3- گروه آزمایشی سوم، افزودن آلدوسترون در طی IVM، ومتعاقباً انجماد تخمک ها در مرحله MII

 

4-1-4- گروه آزمایشی چهارم، یا گروه کننرل………………………………………………………….83

 

4-2- تخمک های منجمد نشده

 

4-2-1- گروه آزمایشی پنجم، افزودن آلدوسترون به محیط IVM تخمک­های غیر منجمد…………..85

 

4-2-2- گروه آزمایشی ششم، افزودن آلدوسترون در روز چهارم جنینی (D4)، به محیط کشت جنین­های حاصل از تخمک­های غیر منجمد…85

 

4-2-3- گروه آزمایشی هفتم، یا گروه کنترل………………………………………………………….86

 

4-3- فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

 

بحث………………………………………………………………………………………………………89

 

نتیجه ­گیری…………………………………………………………………………………………….. 94

 

پیشنهادات……………………………………………………………………………………………… 95

 

منابع…………………………………………………………………………………………………….. 96

 

خلاصه انگلیسی………………………………………………………………………………………..113

 

چکیده:

 

هدف: هدف از این مطالعه بررسی تآثیر آلدوسترون در افزایش توانمندی تکاملی تخمک های منجمد شده گوسفند با افزودن آلدوسترون در مرحله بلوغ تخمک و مرحله کشت جنینی می باشد.

 

مواد و روش ها: تخمک های حاصل از تخمدان های کشتارگاهی، بطور تصادفی به شش گروه آزمایشی تقسیم شدند: گروه های یک و دو: بلوغ تخمک های (IVM) منجمد شده و تازه در حضور آلدسترون و متعاقباً لقاح آزمایشگاهی تخمک ها (IVF) و کشت جنین های حاصله (IVC) (به ترتیب گروه هایVit-IVM  و IVM). گروه های سه و چهار: IVM و IVF تخمک های منجمد شده و تازه، و متعاقباً IVC جنین های حاصله در حضور آلدوسترون در روز چهارم (D4) کشت جنینی (به ترتیب گروه های Vit-D4 و D4).  گروه های پنجم و ششم: IVM، IVF و IVC تخمک های منجمد شده ( Vit-Cont) و تازه (Fresh-Cont) بدون حضور آلدوسترون. جنین ها در مراحل مورولا و بلاستوسیت، توسط آنتی بادی های اولیه بر علیه زیر واحدهایα₁  و β₁ پمپ Na⁺/K⁺/ATPase رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی شدند.

 

نتایج: میزان تفریخ در گروه هایی که در IVM و یا IVC آنها آلدوسترون افزوده شده بود، در هر دو گروه تخمک های منجمد شده و تازه (به ترتیب گروه های Vit-IVM، IVM، Vit-D4 و D4) در مقایسه با گروه های کنترل (به ترتیب Vit-Cont. و Fresh-Cont.) به طور معنی داری بیشتر بود. میزان بیان تحت واحد β₁ پمپ Na⁺/K⁺/ATPase، در گروه های Vit-D4 و D4 به طور معنی داری بیشتر از سایر گروه های بود. همچنین نسبت ICM/Total نیز به طور معنی داری در گروه IVM بیشتر از سایر گروه ها بود.

 

بحث: به طور خلاصه، اضافه نمودن آلدسترون به محیط های کشت IVM و IVC می تواند موجب افزایش معنی دار میزان تفریخ در هر دو گروه تخمک های منجمد شده و تازه گردد. این افزایش میزان تفریخ ممکن است با میزان بیان بیشتر زیر واحد β₁ پمپ Na⁺/K⁺/ATPase، که احتمالاً توسط افزودن آلدوسترون به محیط کشت القا گردیده است، در ارتباط باشد.  

 

مقدمه و معرفی طرح:

 

در سال­های اخیرعلل مختلفی از قبیل بالا رفتن سن ازدواج، تعییر شیوه زندگی، عوامل عفونی و شیمیایی، اشعه و شیمی درمانی، مسائل ژنتیکی و یائسگی زود رس منجر به ناباروری زوج­های بسیاری شده و لذا انجماد و نگهداری تخمک اقدام اساسی در حفظ قدرت باروری و درمان ناباروری به شمار می­رود. با توجه به ضرورت حفظ و نگهداری تخمک در روش­های کمک باروری[1](ART) تلاش­های زیادی جهت انجماد و نگهداری تخمک­ها صورت گرفته است، لیکن تا­کنون روش قابل اعتمادی در انجماد تخمک که بتواند میزان بالایی از زنده مانی تخمک­ها را نشان دهد گزارش نشده است. علی رغم بررسی های متعدد صورت گرفته بر روی تغییرات مورفولوژیک، فراساختاری، فیزیولوژیک و عملکردی تخمک های منجمد- ذوب شده، هنوز اطلاعات اندكی در خصوص وقوع تغییرات ملکولی و بیوشیمیایی ­ایجاد شده در تخمک های مذکور و نیز الگوی بیان پروتیین های مرتبط با توان تكاملی تخمک ها پس از لقاح، به چشم می خورد. با توجه به مطرح بودن این گونه حیوانی به عنوان حیوان مدل انسان برای مطالعات تخمدان و تخمک، خطر انقراض برخی از نژادهای این گونه جانوری، اهمیت این گونه حیوانی از نظر اقتصادی (فراورده های دامی)، نقش آن به عنوان بیوراكتور در مطالعات مرتبط با تولید حیوان تراریخته و نیز عدم انجام مطالعه ای در خصوص بررسی ارتباط بین تجویز آلدوسترون و وضعیت بیان آنزیم Na⁺/K⁺/ATPase در روند تشکیل بلاستوسیست، در مطالعه حاضر به بررسی تاثیرآلدوسترون در بهبود کیفی تخمک های منجمد شده پرداخته خواهد شد. 

 

بدین منظور تخمك های استحصال شده از تخمدان های كشتارگاهی گوسفند، در مرحله GV از تقسیمات میوزی به روش کرایوتاپ و با استفاده از روش انجماد شیشه ای منجمد و پس از گذشت یك هفته ذوب شده و پس از لقاح، مراحل تكاملی آنها در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار می گیرد.

 

فصل اول: کلیات

 

1-1- بیان مسأله

 

با وجود دستیابی به کارآیی نسبتاً بالا در تکنیک های انجماد اسپرم و جنین در پستانداران و از جمله گونه گوسفند، هنوز تکنیک مؤثری به منظور انجماد تخمک های این گونه حیوانی شناسایی نگردیده است. از جمله مهم ترین اهداف انجماد تخمک در نمونه های حیوانی می توان به حفظ و مدیریت ذخایر ژنتیکی، توسعه علم مهندسی ژنتیک، ارتقای تکنیک انتقال هسته[1] (NT) در روند شبیه سازی، تهیه منابع کافی جهت انجام تحقیقات بنیادین، صادرات کم هزینه صفات ژنتیکی برتر و ایجاد بانک تخمك اشاره نمود. علاوه بر این با حفظ و ذخیره سازی طولانی مدت این منابع (تخمك) امکان اعمال برنامه های مدیریتی قویتر در مورد گونه های جانوری در معرض خطر انقراض و در انسان نیز امکان حفظ باروری در زنان در معرض خطر اختلال در عملکرد تخمدان به علت درمانهای خاص (شیمی و پرتو درمانی)، جراحی، نارسایی زودرس تخمدان و … فراهم می گردد؛ ضمن این که انجماد تخمک در نمونه های انسانی هیچ یک از مشکلات و محدودیت های اخلاقی و حقوقی انجماد جنین را نیز به همراه ندارد.  مطالعات نشان می دهند که در تخمک های منجمد- ذوب شده، آسیب های فراساختاری، مورفولوژیک، فیزیولوژیک و عملکردی متعددی به چشم می خورد که مهم ترین آنها عبارتند از: وارد شدن صدمات غیرقابل برگشت به غشاء پلاسمایی تخمك، کاهش نفوذپذیری انتخابی غشاء پلاسمایی، اگزوسیتوز زودرس گرانول های کورتیکال، سفت و سخت شدن زوناپلوسیدا، کاهش شدید میکروویلی ها، بهم ریختگی شدید اووپلاسم، تغییرات شدید و کاهش مشخص دستجات میکروتوبول ها و میکروفیلامان ها، بهم ریختگی دوک تقسیم و حرکت اجزاء اطراف سانتریول ها به مرکز تخمك، خرد شدن هسته، افزایش احتمال پارتنوژنزیس، کاهش شدید فاکتور پیش­برنده میتوز MPF[2]، کاهش مشخص متابولیت ها و پروتئین ها، آنپلوییدی و پلی پلوییدی اشاره نمود .

 

در این مطالعه به بررسی افزودن برخی عوامل مؤثر در روند اتجماد تخمک مانند آلدوسترون در محیط های اختصاصی کشت جنین و تأثیر آنها بر بیان پروتیین مورد نظر (Na/K ATpase)در مراحل مختلف جنینی
می پردازیم. بدیهی است نتایج حاصل از این مطالعه ضمن مشخص نمودن میزان تاثیر عامل افزوده شده بر روند تکامل تخمك و جنین های حاصله از انجماد، امكان ارتقای كیفی روش های انجمادی تخمك مبتنی بر نتایج بدست آمده را نه تنها در این گونه جانوری بلكه در سایر پستانداران از جمله انسان فراهم نموده و بدین ترتیب گامی موثر در جهت رفع معضل تکامل تخمک های انجمادی از مورولا به بلاستوسیست در پستانداران برداشته خواهد شد. لازم به ذکر است تا به حال تأثیر آلدوسترون در روند تکاملی جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده گوسفند بررسی نگردیده است و در صورت وجود تأثیر مثبت در این زمینه، موجب تحول روش های انجماد تخمک در گوسفند و حتی سایر گونه ها خواهد شد.

 

2-1- اهداف پژوهش

 

1- بررسی تأثیر هورمون آلدوسترون افزوده شده در طی IVM و مراحل مختلف جنینی بر عملکرد پمپ های Na⁺/K⁺/ATPase موجود در غشای بازولترال تروفکتودرم جنینی و برطرف شدن توقف جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده، در مرحله مورولا .

 

2- ارتقای پروتکل های انجماد تخمک در گوسفند با هدف ارتقای کیفی(جنین­های حاصله از افزایش میزان تفریخ، ICM/Total) عملکرد اجزای داخل سلولی و یا کاهش آسیب های ساختاری تخمک در روند تکامل جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده.

 

3-1- ضرورت انجام تحقیق

 

این پروژه با هدف پاسخ به برخی از سؤال های زیر طراحی گردید: بررسی تأثیر هورمون آلدوسترون افزوده شده در مراحل مختلف جنینی بر عملکرد پمپ های Na⁺/K⁺/ATPase موجود در غشای بازولترال تروفکتودرم جنینی و برطرف شدن توقف جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده، در مرحله مورولا؛ بررسی ارتباط بین تجویز هورمون های فعال کننده تحت واحد های 1α و 1β پمپ Na+/K+/ATPase و میزان افزایش عملکرد آنزیم مذکور در مرحله انتقال از مورولا به بلاستوسیست و متعاقباً بهبود روند تکاملی جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده و ارتقای پروتکل های انجماد تخمک در گوسفند با هدف ارتقای عملکرد اجزای داخل سلولی و یا کاهش آسیب های ساختاری تخمک در روند تکامل جنین های حاصل از تخمک های منجمد- ذوب شده.

 

4-1- تولید جنین در شرایط In vivo

 

1-4-1- روند ایجاد سلول جنسی ماده

 

واحدهای عملكردی تخمدان فولیكول نام دارند كه تحت سازماندهی سلولی خاص تخمک را در خود جای داده‌اند. این سازماندهی سلولی ثابت نبوده و در طی مراحل مختلف زندگی فولیكول تغییرات پیچیده‌ای می‌یابد. حاصل این تغییرات به آزاد شدن تخمک و یا تحصیل فولیكول رسیده منجر خواهد شد ]132،54[.

 

تولید مثل با تكامل تخمك‌ها در تخمدان آغاز می‌گردد. تعداد 1 تا 25 تخمك، بسته به گونه حیوان، در مرحله‌ای از سیكل جنسی حیوان ماده به نام فاز اوولاسیون  از فولیكول تخمدانی به داخل حفره شكمی آزاد می‌شوند. سپس این تخمك‌ها از طریق لوله رحمی مربوطه وارد رحم می‌شوند. فولیكول‌های تخمدانی متعددی در مراحل مختلف تكاملی در استرومای كورتكس واقع شده‌اند. بیشترین فولیكول‌ها، فولیكول‌های پریموردیال هستند. هر فولیكول پریموردیال حاوی یك تخمک اولیه است كه توسط یك لایه از سلول‌های فولیكولی سنگفرشی احاطه شده است. در ادامه رشد این فولیكول‌ها، سلول‌های فولیكولی تبدیل به سلول‌های مكعبی یا استوانه‌ای كوتاه می‌شوند ]148،81 [.

 

مجموع وقایعی كه منجر به تولید سلول زایایی تخمک در جنس ماده می‌شود، باعث بروز تمامی واكنش‌های لازم قبل، حین و بعد از واكنش با اسپرم در تخمک می ‌شود که شامل یك پروسة طولانی از تمایز اووگونی در تخمدان جنینی تا بلوغ نهایی تخمک، درست قبل از اوولاسیون آن می‌باشد.

 

از مدت‌ها قبل مشخص شده كه فقط تعداد كمی از تخمک‌های اولیه حیوانات و نیز انسان می‌توانند رشد ثانویه خود را دنبال کرده، تبدیل به تخمک ثانویه شده و تخمك‌گذاری كنند. بطور مثال در مورد گاو تخمین زده اند که در تخمدان‌های گوساله تازه متولد شده حدود 200.000 تخمک وجود دارد که احتمالاً كمتر از 300 عدد آن‌ها به مرحله تخمك‌گذاری می‌رسند] 52،136،20[.

 

 

1-7-4 اثرات سوء کودهای شیمیایی………………………………………. 19

 

1-7-5 دلایل اهمیت استفاده از کودهای زیستی…………………………. 20

 

1-7-5-1 اهمیت کودهای بیولوژیک در سلامتی انسان………………….. 21

 

1-8- پیشینه استفاده از کودهای زیستی…………………………………. 22

 

1-9- جایگاه تولید كودهای زیستی در ایران و جهان……………………… 23

 

1-10- تولید کودهای زیستی………………………………………………. 25

 

1-10-1 ویژگی ماده حامل………………………………………………….. 26

 

1-11- کودهای زیستی باکتریایی………………………………………….. 27

 

1-12- کودهای زیستی فسفاته……………………………………………. 28

 

1-13- لیگنیت…………………………………………………………………. 29

 

1-14- ویژگی های گیاه تربچه………………………………………………. 30

 

1-14-1 خصوصیات گیاه شناسی………………………………………….. 30

 

1-14-2 شرایط اقلیمی………………………………………………………. 31

 

1-14-3 کشت تربچه…………………………………………………………. 33

 

1-15- اهداف تحقیق…………………………………………………………. 34

 

1-16- فرضیه های تحقیق…………………………………………………… 34

 

فصل دوم: مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق

 

2-1- پیشینه تحقیق…………………………………………………………. 36

 

2-2- هدف پژوهش……………………………………………………………. 40

 

فصل سوم: روش اجرای تحقیق

 

3-1- تهیه کشت جوان و اطمینان از خالص بودن سویه نگهداری شده…..42

 

3-1-1 رنگ آمیزی گرم………………………………………………………… 42

 

3-1-2 تکنیک کاور اسلیپ……………………………………………………. 42

 

3-2- پیش تست سویه مورد نظر برای اطمینان مجدد از انحلال فسفات در مقیاس آزمایشگاهی…43

 

3-3- ارزیابی به کارگیری افزودنی­های لازم برای افزایش بقا سویه مورد نظر نسبت به تنش های محیطی مشتمل بر خشکی، شوری، دما، UV، pH

 

3-3-1 آماده سازی ماده حامل جهت تلقیح با باکتری……………………. 44

 

3-3-2 اعمال تنش های محیطی بر روی تیمارها………………………… 45

 

3-3-2-1 محیط کشت استارچ کازئین آگار…………………………………. 46

 

3-3-2-2 محلول  كدورت سنجی مك فارلند……………………………….. 46

 

3-3-2-3 محلول رقیق كننده………………………………………………… 47

 

3-4- اعمال بهترین تیمار به گلدان ها و بررسی پایداری باکتری در ریزوسفر گیاه تربچه…47

 

3-4-1 روش كشت گلدانی تربچه…………………………………………… 47

 

3-5- تاثیر سطوح مختلف تلقیح بر روی بقاء در سطح بذر تربچه…………48

 

3-6- تاثیر سطوح مختلف تلقیح به کار برده شده در جذب فسفات توسط گیاه تربچه…48

 

3-6-1 اندازه گیری غلظت فسفر گیاه تربچه………………………………. 48

 

3-6-2 روش ساخت معرف وانادات – مولیبدات……………………………. 49

 

3-6-3 روش تهیه محلول های استاندارد فسفر و رسم منحنی استاندارد…49

 

3-7- بررسی بقاء باکتری در حامل‏های مختلف…………………………… 50

 

3-8- نگهداری سویه مورد نظر برای مطالعات بعدی……………………….50

 

3-8-1 محیط كشت نوترینت براث (Nutrient Broth)……………………….51

 

 

3-8-2 محیط كشت TSA…………………………………………………….

 

3-9- نتایج آنالیز خاک گلدان قبل از آزمون و پس از آزمون………………..52

 

3-10-  تجزیه وتحلیل آماری داده ها………………………………………. 52

 

فصل چهارم: تجزیه و تحلیل داده ‏ها

 

4-1- تهیه محیط کشت تازه و اطمینان از خالص بودن سویه نگهداری شده….54

 

4-2- پیش تست سویه مورد نظر برای اطمینان مجدد از انحلال فسفات….54

 

4-3- تاثیر مواد حامل بر بقاء سویه باکتری……………………………… 55

 

4-3-1 تاثیر تنش دمایی بر افزایش بقاء باکتری در فرمول……………….55

 

4-3-2 تاثیر تنش شوری بر افزایش بقاء باکتری در فرمول……………….65

 

4-3-3 تاثیر تنش خشکی بر افزایش بقا باکتری در فرمول…………….. 73

 

4-3-4 تاثیر تنش PH بر افزایش بقا باکتری در فرمول…………………… 76

 

4-3-5 تاثیر تنش UV بر افزایش بقا باکتری در فرمول…………………… 84

 

4-4- اعمال بهترین تیمار به گلدان و بررسی پایداری باکتری در ریزوسفر گیاه…89

 

4-6- تاثیر سطوح مختلف تلقیح به کار برده شده در جذب فسفات توسط گیاه و نتایج آنالیز فسفات خاک گلدان‏ها و آنالیز فسفات گیاه…96

 

4-7- بررسی بقاء باکتری در حامل‏های مختلف………………………… 103

 

فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادات

 

5-1- نتیجه گیری………………………………………………………….. 111

 

5-2- پیشنهادات…………………………………………………………… 119

 

منابع و مآخذ……………………………………………………………….. 121

 

فهرست منابع فارسی……………………………………………………. 121

 

فهرست منابع انگلیسی………………………………………………….. 123

 

چکیده انگلیسی…………………………………………………………… 126

 

چکیده:

 

مصرف بی رویه کودهای شیمیایی موجب عدم تعادل عناصر و مواد غذایی موجود در خاک، کاهش بازده محصولات کشاورزی و به خطر افتادن سلامت انسان­ها و دیگر موجودات زنده شده است. به همین علت امروزه استفاده از کودهای زیستی مورد توجه قرار گرفته است. باکتری­های حل کننده فسفات برای افزایش فراهمی فسفر مورد نیاز گیاه کارآمد به نظر می رسند. با توجه به اینکه اغلب خاک های ایران آهکی بوده و در اقلیم‏های خشک و نیمه خشک هستند، وجود pH بالا، درصد زیاد کربنات کلسیم، کمبود مواد آلی و خشکی خاک باعث شده اند که جذب فسفر کمتر از مقدار لازم برای تامین رشد بهینه اغلب محصولات کشاورزی باشد، لذا هدف از این پژوهش بررسی تاثیر spp.  Streptomyces جدا شده از خاک بر انحلال فسفات به منظور تولید کود زیستی فسفاته می باشد. جهت حداکثر افزایش بقاء باکتری در ماده حامل از سطوح تلقیح مختلفی که شامل لیگنیت و مواد تکمیلی پودر سویا و خاک فسفاته با نسبتهای مشخص بود استفاده شد و این مواد حامل تلقیح شده تحت تنشهای دما، شوری، خشکی، pH و uv قرار گرفتند همچنین کلیه مواد حامل ساخته و تلقیح شده بطور جداگانه در یک بازه زمانی 90 روز از لحاظ بررسی بقاء باکتری سنجیده شدند. بهترین فرمول به دست آمده از تنشها در گلدان به کارگیری شد. همچنین تیمارهای دیگری نیز از لیگنیت با سطوح مختلف ساخته و با باکتری و بذر تربچه تلقیح شد و بقاء باکتری در بازه 24 ساعته اندازه گیری شد و بعد از آن در گلدان به کار گرفته شدند. با توجه به نتایج به دست آمده بهترین فرمول به دست آمده از تنش­ها و بازه زمانی 90 روز، فرمول لیگنیت + خاک فسفات 2% + سویا 1% تعیین شد و بعد از بکارگیری در گلدان بهترین نتیجه را نسبت به سایر مواد حامل و کنترل نشان داد و پارامترهای رشد گیاه تربچه و جذب فسفات گیاه را بهتر از تمامی مواد حامل و کنترل افزایش داده است. از بین تیمارهای ساخته شده و تلقیح شده به بذر تیمار شامل 200 گرم حامل + خاک مزرعه بهترین نتایج را نشان داد و بعد از به کارگیری تیمارها در گلدان نیز تیمار شامل 200 گرم حامل + خاک مزرعه بهترین نتیجه را نشان داد. این فرمول بهترین نتیجه را در پارامترهای رشد گیاه تربچه و جذب فسفات گیاه نسبت به سایر تیمارها نشان داد. در یک نتیجه گیری کلی، فرمول لیگنیت + خاک فسفات 2% + سویا 1% به عنوان فرمول نهایی و اصلی برای به کارگیری در آزمایشات بعدی و مقیاس مزرعه پیشنهاد می‏گردد.

 

فصل اول: کلیات تحقیق

 

1-1- مقدمه

 

طی چند دهه اخیر به علت افزایش جمعیت و تقاضای روزافزون برای مواد غذایی، مصرف کود های شیمیایی به منظور افزایش مقدار تولید در واحد سطح به شدت افزایش یافته است. استفاده از کودهای شیمیایی فسفاته تاریخچه دیرینه ای دارد و به انقلاب سبز و معرفی کودهای شیمیایی بر می گردد(ساریخانی و همکاران 1389، 13).‏‏‏ مصرف بی رویه کودهای شیمیایی موجب عدم تعادل عناصر و مواد غذایی موجود در خاک، کاهش بازده محصولات کشاورزی و به خطر افتادن سلامت انسان ها و دیگر موجودات زنده خواهد شد. نیاز به جایگزینی مناسب برای کودهای شیمیایی زمانی احساس می شود که بدانیم علاوه بر آسیب های زیست محیطی ناشی از کاربرد کودهای شیمیایی، محدود بودن منابع، افزایش قیمت تمام شده و تثبیت شدن قسمت اعظمی از کودهای فسفاته مصرفی به شکل غیرقابل استفاده برای گیاه نیز پیامدهای استفاده از این کودهای شیمیایی هستند(ساریخانی و همکاران 1389، 13).

 

ضرورت یافتن جایگزینی مناسب برای رهاسازی فسفات تجمع یافته در خاک زمانی بیشتر احساس می شود که  بر این امر واقف گردیم که منابع فسفات موجود در خاک  قابلیت تامین فسفات مورد نیاز گیاهان برای تولید بهینه تا صد سال را دارا می باشد. بنابراین کافی است که این منبع عظیم فسفر را به صورت قابل جذب و استفاده برای گیاه تبدیل نمود (Bashan 1998, 16). به همین علت امروزه استفاده از کودهای بیولوژیک مورد توجه قرار گرفته است که مکانیسم عمل آنها قابلیت جذب عناصر غذایی گیاه در خاک را افزایش می‏دهد. باکتری­های حل کننده فسفات برای افزایش فراهمی فسفر مورد نیاز گیاه کارآمد به نظر       می رسند (Bashan 1998, 16). فسفر در خاک‌ها به دو شکل آلی و معدنی  وجود دارد اما غلظت فسفات محلول در خاک معمولاً خیلی پایین است (Bashan 1998, 16). قسمت اعظم میکرو ‏‏ارگانیسم‏های محلول کننده فسفات در ریزوسفر گیاهان متمرکز شده‌اند. میکروب‏های خاک توانایی تبدیل اشکال نامحلول فسفر به اشکال محلول را دارند. ترکیبات آلی و معدنی خارج شده از ریشه، باعث افزایش جمعیت میکروبی در اطراف ریشه می‌گردند . با توجه به اینکه میکروارگانیسم‏های محلول کننده فسفات در خاک به طور طبیعی وجود دارند و موجب افزایش فسفر قابل دسترس و تحریک رشد گیاه می‌شوند، اما تعداد آن‌ها در خاک به اندازه کافی نیست تا با سایر میکروارگانیسم‏هایی که در ریزوسفر قرار دارند رقابت کنند. بنابراین تلقیح گیاهان با میکروارگانیسم‏های محلول کننده فسفات اثرات مفیدی دارد. باکتری­های حل کننده فسفات طی سه مکانیسم تولید اسیدهای آلی، کلات کردن و واکنش های تبادل لیگاند موجب انحلال ترکیبات نامحلول فسفات می‏شوند. طی فرآیند انحلال بخشی از فسفر محلول، توسط باکتری حل کننده فسفات استفاده می‏شود اما از آنجائیکه مقدار فسفر حل شده بیش از نیاز باکتری‏ها است لذا این مقدار آزاد می‏تواند در اختیار گیاه قرار گیرد. اغلب خاک‏های ایران دارای آهک و گچ بوده و این امر می‏تواند موجب تثبیت فسفر شود. در نتیجه فسفر جذب ذرات کلوئیدی خاک شده و از دسترس گیاه خارج می شود. بنابراین در غالب خاک‌ها از نظر مقدار فسفر کل مشکل وجود ندارد، بلکه مشکل، در دسترس قرار گرفتن آن می‌باشد. فسفر جذب عناصری مانند Ca²⁺، Fe³⁺  و Al³⁺ شده و باعث تشکیل ترکیبات نامحلول می‌گردد (Bhattacharyya and Jha 2012, 28).

 

 

2ـ11ـ2ـ نحوه انتقال هورمون در خون…………………………………………………………….9

 

2ـ11ـ3ـ نحوه تاثیر هورمون ها…………………………………………………………………….9

 

2ـ11ـ4ـ غده هیپوفیز…………………………………………………………………………………10

 

2ـ12ـ ویژگی های عمومی اکسی توسین……………………………………………………… 10

 

2ـ13ـ نقش اکسی توسین………………………………………………………………………… 11

 

2ـ14ـ کنترل ترشح اکسی توسین…………………………………………………………………. 11

 

2ـ15ـ توزیع و نقش گیرنده های اکسی توسین…………………………………………………… 12

 

2ـ16ـ فعال سازی سیگنالینگ PKC از طریق Gـ پروتئین………………………………………….. 13

 

فصل سوم: مواد و روش ها……………………………………………………………………………. 15

 

3ـ1ـ جمع آوری نمونه…………………………………………………………………………………… 16

 

3ـ2ـ نمونه گیری…………………………………………………………………………………………. 16

 

3ـ3ـ مواد و محلول های مورد نیاز برای انجام استخراج……………………………………………….16

 

3ـ4ـ مراحل استخراج……………………………………………………………………………………..  17

 

3ـ5ـ واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR)………………………………………………………………. 18

 

3ـ6ـ بررسی پلی مورفیسم rs2254298 ژن OXTR…………………………………………………

 

3ـ7ـ فرایند انجام واکنش PCR………………………………………………………………………..

 

3ـ7ـ1ـ  مواد و وسایل مورد نیاز برای انجام PCR…………………………………………………….

 

3ـ7ـ2ـ محلول های مورد نیاز برای واکنش PCR………………………………………………….

 

3ـ7ـ3ـ روش کار…………………………………………………………………………………………20

 

3ـ7ـ4ـ مراحل انجام PCR……………………………………………………………………………..

 

3ـ8ـ RFLPـPCR……………………………………………………………………………………….

 

3ـ8ـ1ـ مراحل و مواد مورد نیاز برای انجام RFLP…………………………………………………..

 

 

3ـ8ـ2ـ آنزیم BsrӀ…………………………………………………………………………………….

 

3ـ8ـ3ـ روش کار…………………………………………………………………………………………23

 

3ـ9ـ مراحل و مواد مورد نیاز برای انجام الکتروفورز…………………………………………………..24

 

3ـ9ـ1ـ مواد مورد نیاز…………………………………………………………………………………….24

 

3ـ9ـ2ـ تهیه ژل آگارز 3 درصد………………………………………………………………………….. 24

 

3ـ10ـ بررسی پلی مورفیسم rs53576…………………………………………………………….

 

3ـ10ـ1ـ آنزیم BamHӀ…………………………………………………………………………………

 

3ـ10ـ2ـ روش کار……………………………………………………………………………………….. 26

 

3ـ11ـ آنالیز آماری…………………………………………………………………………………………26

 

فصل چهارم: نتایج………………………………………………………………………………………..27

 

4ـ1ـ اطلاعات بیماران و افراد سالم…………………………………………………………………….28

 

4ـ2ـ بررسی پلی مورفیسم rs2254298 در ژن گیرنده اکسی توسین……………………………. 29

 

 آنالیز آماری……………………………………………………………………………………………….. 30

 

4ـ3ـ بررسی پلی مورفیسم برای (A/G) ژن OXTR………………………………………………..

 

4ـ3ـ1ـ آنالیز آماری……………………………………………………………………………………… 33

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری و ارائه پیشنهادات………………………………………………..34

 

5ـ1ـ بحث………………………………………………………………………………………………….35

 

5ـ2ـ پیشنهادات…………………………………………………………………………………………… 37

 

مراجع…………………………………………………………………………………………………….. 38

 

چکیده: