1-4-2-3- برخی از خواص پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………….. 12

 

1-4-2-3-1- خاصیت ضد فشار خون……………………………………………………………… 12

 

1-4-2-3-2- فعالیت آنتی­اکسیدانی………………………………………………………………… 14

 

1-5- مشکلات ناشی از مصرف شیر در افراد…………………………………………………………………….. 15

 

1-5-1- عدم تحمل لاکتوز……………………………………………………………………………………………. 15

 

1-5-2- آلرژی به پروتئین­های شیر……………………………………………………………………………… 16

 

عنوان                                                                                                                      صفحه

 

1-5-2-1- معرفی انواع آزمون­های رایج جهت مطالعه­ی فرآیند آلرژی……………… 18

 

1-5-2-2- آزمون الایزا……………………………………………………………………………………………. 19

 

1-6- قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین­ها……………………………………………………………………………. 20

 

فصل دوم: مروری بر پژوهش­های پیشین………………………………………. 23

 

فصل سوم: مواد و روش­های تحقیق

 

3-1- مواد مصرفی………………………………………………………………………………………… 27

 

3-2- تهیه­ی محلول­ها……………………………………………………………………………. 28

 

3-2-1- تهیه­ی محلول­های کازئینی، کازئین­بتا و تعیین غلظت آن­ها………………………. 28

 

3-2-2- تهیه­ی محلول برادفورد و رسم نمودار استاندارد آن با

 

 استفاده از کازئین­بتا……………………………………………………………………………. 28

 

3-2-3- تهیه­ی محلول­های مورد نیاز برای الکتروفورز ژلی………………………………………… 30

 

3-2-3-1-تهیه محلول SDS 20 درصد………………………………………………………………… 30

 

3-2-3-2- تهیه محلول آمونیوم پر سولفات (APS)……………………………………………… 30

 

3-2-3-3- تهیه محلول آکریلامید و بیس آکریلامید…………………………………………… 31

 

3-2-3-4- تهیه بافر تریس 5/1 مولار…………………………………………………………………… 31

 

3-2-3-5- تهیه بافر تریس 5/0 مولار…………………………………………………………………… 31

 

3-2-3-6- تهیه بافر تانک به حجم 500 میلی­لیتر……………………………………………… 31

 

3-2-3-7- تهیه بافر نمونه X2………………………………………………………………………………. 32

 

3-2-3-8- تهیه 100 میلی­لیتر محلول کوماسی­بلو……………………………………………… 33

 

3-2-3-9- تهیه محلول رنگ بر ژل………………………………………………………………………… 33

 

3-2-4- تهیه محلول OPA به حجم 50 میلی­لیتر……………………………………………………. 33

 

3-2-5- تهیه محلول فلورسامین…………………………………………………………………………………… 34

 

 عنوان                                                                                                                      صفحه

 

3-2-6- تهیه محلول ANS…………………………………………………………………………………………… 35

 

3-2-7-  تهیه محلول ABTS رادیکال…………………………………………………………………………. 36

 

3-2-8- تهیه عصاره­ی ACE از پودر استون شش خرگوش……………………………………… 37

 

3-3-روش­ها………………………………………………………………………………………… 38

 

3-3-1- تخلیص کازئین­بتا شیرگاو……………………………………………………………………………….. 38

 

3-3-2- تخلیص هموگلوبین A از خون انسان……………………………………………………………. 39

 

3-3-3- تعیین میزان خلوص پروتئین با استفاده از SDS-PAGE…………………………… 40

 

3-3-4- تهیه پودر استون شش خرگوش…………………………………………………………………….. 40

 

3-3-5- قندی کردن کازئین­بتا و کازئین­های شیرگاو به روش غیرآنزیمی………………. 41

 

3-3-6- آزمون­های OPA و فلورسامین برای تایید فرآیند

 

قندی شدن غیرآنزیمی………………………………………………………….. 41

 

 

3-3-7- مطالعه­ی فلورسانس ذاتی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی……………………. 42

 

3-3-8- مطالعه­ی فلورسانس عارضی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی……………….. 43

 

3-3-9- مطالعه تغییرات ساختاری کازئین­های بتای قندی و غیرقندی،

 

با استفاده از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………. 43

 

3-3-10- مطالعه­ی فعالیت چاپرونی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی………………… 44

 

3-3-11- هضم کازئین­های شیرگاو و کازئین­بتای قندی و غیرقندی

 

به وسیله­ی آنزیم­های تریپسین و کیموتریپسین پانکراس گاوی…………………………………. 44

 

3-3-12- مطالعه­ی فعالیت آنتی­اکسیدانی کازئین­های شیرگاو کازئین­بتای

 

 قندی و غیرقندی…………………………………………………………………………. 45

 

3-3-13- مطالعه­ی فعالیت مهار آنزیم ACE به وسیله­ی کازئین­بتا

 

 قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آن­ها……………………………………… 47

 

3-3-14- مطالعه­ی توان آلرژی­زایی کازئین­ها و کازئین­بتای قندی

 

 و غیرقندی……. 47

 

عنوان                                                                                    صفحه

 

3-3-15- آزمون آماری…………………………………………………………………….. 48

 

 فصل چهارم: نتایج و بحث

 

4-1- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت­های زیستی

 

(چاپرونی، آنتی­اکسیدانی و مهار آنزیمACE ) و آلرژی­زایی کازئین­بتا………………………………. 50

 

4-1-1- تخلیص پروتئین کازئین­بتا………………………………………………………………………………. 50

 

4-1-2- تخلیص هموگلوبینA از خون انسان……………………………………………………………… 51

 

4-1-3- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا

 

در حضور ماده­ی احیا کننده………………………………………………… 52

 

4-1-3-1- مطالعه­ی قندی شدن کازئین­بتا با استفاده از ترکیب OPA……………… 53

 

4-1-3-2- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا با استفاده

 

 از ترکیب فلورسامین…………………………………………….. 54

 

4-1-3-3- استفاده از ژل SDS-PAGE احیایی برای تایید فرآیند

 

قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا……………………………………………………………………………… 55

 

4-1-4- مطالعه­ی فلورسانس ذاتی و عارضی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی…… 56

 

4-1-5- مطالعه ساختار دوم کازئین­های بتای قندی و غیرقندی با استفاده

 

از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………………………………………………………. 58

 

4-1-6- مطالعه فعالیت چاپرونی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی………………………. 60

 

4-1-7- هضم آنزیمی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی با آنزیم­های

 

 تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 62

 

4-1-7-1- تایید فرآیند هضم آنزیمی با استفاده از ژلSDS-PAGE

 

(15درصد) احیایی……………………………………………………………………………………………………… 63

 

عنوان                                                                                                                      صفحه

 

4-1-7-2- مطالعه فعالیت آنتی­اکسیدان کازئین­های بتای قندی

 

 و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آن­ها………………………………………………………… 65

 

4-1-7-3- مطالعه خاصیت مهار آنزیم ACE به وسیله­ی کازئین­های

 

بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آن­ها………………………… 71

 

4-1-8- مطالعه آلرژی­زایی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای

 

حاصل از هضم آنزیمی آن­ها…………………………………………………………………………………………… 73

 

4-2- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت آنتی­اکسیدانی

 

 و آلرژی­زایی کازئین­های شیرگاو…………………………………………………………………………………………. 77

 

4-2-1- جداسازی و قندی کردن کازئین شیرگاو……………………………………………………….. 77

 

4-2-2- تایید فرآیند قندی شدن کازئین­های شیرگاو……………………………………………….. 77

 

4-2-2-1- استفاده از ژل SDS-PAGE (12 درصد) برای تایید

 

 قندی شدن غیرآنزیمی…………………………………………………………………………………………….. 77

 

4-2-2-2- استفاده از ترکیب OPA برای مطالعه­ی قندی شدن غیرآنزیمی

 

کازئین­های شیرگاو……………………………………………………………………………………………………… 78

 

4-2-3- هضم آنزیمی کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو با آنزیم­های

 

 تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 80

 

4-2-4- مطالعه فعالیت آنتی­اکسیدان کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو

 

 و پپتیدهای حاصل از هضم آن­ها………………………………………………………………………………….. 82

 

4-2-5- مطالعه آلرژی­زایی کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو و پپتیدهای

 

 حاصل از هضم آنزیمی آن­ها به وسیله­ی دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین………….. 86

 

 

 

عنوان                                                                                                                      صفحه

 

خلاصه­ی نتایج ………………………………………………………………………………. 90

 

 نتیجه­گیری نهایی……………………………………………………………………………………. 91

 

فهرست منابع و مآخذ       92

 

شیر

 

شیر یک مایع زیستی پیچیده متشکل از آب، پروتئین، چربی، کربوهیدرات، مواد معدنی و برخی ترکیبات فعال زیستی از جمله آنزیم­ها و ویتامین­ها می­باشد که به عنوان اولین ماده غذایی برای نوزاد، بوسیله غدد پستانی موجودات پستاندار ساخته می­شود. در اوایل دوران شیردهی، شیر آغوز[1] نامیده می­شود که سرشار از آنتی­بادی­هایی است که خطر ابتلای نوزاد به بسیاری از بیماری­ها را کاهش می­دهد. شیر به عنوان اولین ماده­ی غذایی برای نوزاد شامل اکثر ترکیبات ضروری و مورد نیاز برای رشد و نمو است. در شکل (1-1) ترکیبات اصلی موجود در شیر مشاهده می­شود (Pehrsson، 2000).