1-7-5-1- اکتینومایسین…………………………………………………………………………………………………………..11

 

1-7-5-1-1- داکتینومایسین……………………………………………………………………………………………………..11

 

1-7-5-2-آنتراسیکلین………………………………………………………………………………………………………………13

 

1-7-5-2-1-دانوروبیسین………………………………………………………………………………………………………….14

 

1-7-5-2-2-دوکسوروبیسین هیدروکلراید…………………………………………………………………………………..16

 

1-7-5-3- میترامایسین………………………………………………………………………………………………………………17

 

1-7-5-4 بلئومایسین سولفات…………………………………………………………………………………………………….19

 

1-7-5-5- میتومایسین‌ها……………………………………………………………………………………………………………21

 

1-7-5-5-1 میترامایسین C………………………………………………………………………………………………………..22

 

1-7-5-6- استرپتوزوستین…………………………………………………………………………………………………………22

 

1-8-سرطان ریه………………………………………………………………………………………………………………………..23

 

1-8-1- علائم سرطان ریه……………………………………………………………………………………………………….. 26

 

1-8-2- سرطان در ایران…………………………………………………………………………………………………………… 26

 

1-9-اکتینومیست‌ها…………………………………………………………………………………………………………………….28

 

1-9-1-متابولیت‌های ثانویه‌ی اکتینومیست‌ها………………………………………………………………………………….30

 

1-10-هدف از پژوهش………………………………………………………………………………………………………………33         

 

فصل دوم: پیشنه‌ی تحقیق                                                                                               

 

فصل سوم: مواد و روش­ها                                                                                              

 

3-1- ترکیبات استفاده شده………………………………………………………………………………………………………….39

 

3-2- دستگاه های استفاده شده……………………………………………………………………………………………………42

 

3-3- سویه‌های اکتینومیست………………………………………………………………………………………………………..43

 

تولید اسپور باکتری………………………………………………………………………….43

 

3-5- آماده‌سازی محیط پیش کشت………………………………………………………………………………………………44

 

3-6- آماده‌سازی محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………………………………44

 

3-7- احیا و کشت سویه…………………………………………………………………………………………………………….45

 

3-8- تهیه پیش کشت……………………………………………………………………………………………………………… 45

 

3-9- تولید متابولیت‌ها………………………………………………………………………………………………………………45

 

3-10- استخراج متابولیت‌ها………………………………………………………………………………………………………45

 

3-11- نگهداری عصاره‌ها………………………………………………………………………………………………………..46

 

3-12-1- کشت آرتمیا……………………………………………………………………………………………………………..46

 

3-12-2- آزمون ارزیابی سمیت در آرتمیا…………………………………………………………………………………..47

 

3-13- غربالگری ثانویه، ارزیابی سمیت در کشت سلولی……………………………………………………………..48

 

3-13-1- انتخاب دودمان سلولی…………………………………………………………………………………………….. 48

 

3-13-1-1 محیط کشت………………………………………………………………………………………………………….49

 

3-13-1-1-1- مراحل تهیه محیط کشت دودمان سلولی A549…………………………………………………..49

 

3-13-1-1-2-تجدیدکشت دودمان سلولی A549……………………………………………………………………..50

 

3-13-1-1-3- شمارش سلول‌ها و بررسی میزان فعالیت سلول…………………………………………………..51

 

3-13-2- تهیه محلول تریپسین………………………………………………………………………………………………….52

 

3-14- آزمون MTT………………………………………………………………………………………………………………..53

 

3-15- شمارش سلول برای انجام آزمونMTT……………………………………………………………………………54

 

ژوهش……………………………………………………………………….54

 

 

3-17- بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها تیمار شده با عصاره اکتینومیست‌ها……………………………………..55

 

3-18- شناسایی سویه‌های منتخب اکتینومیست………………………………………………………………………….56

 

3-18-1- بررسی مورفولوژی میکروسکوپی……………………………………………………………………………. 56

 

3-18-2- بررسی میسلیوم‌های هوایی و آرایش زنجیره اسپوری……………………………………………………56

 

3-18-3- بررسی رشد میسلیومی در محیطISP2 broth………………………………………………………………56

 

3-19-  مطالعه شیمیوتاکسونومی………………………………………………………………………………………………56

 

3-19-1- تهیه بیومس برای تعیین ایزومر دی آمینوپامیلیک اسید(DAP)……………………………………………56

 

3-20- شناسایی توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA سویه‌های منتخب…………………………………………….. 58

 

3-20-1- تهیه محیط کشت Luria Broth(LB)……………………………………………………………………………..58

 

3-20-2- تهیه زیست توده برای مطالعات فیلوژنتیک……………………………………………………………………..59

 

3-20-3- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………………59

 

3-20-4- تائید بررسی کیفیت استخراج DNA………………………………………………………………………………61

 

3-20-4-1- تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………………..61

 

3-20-4-1-1- تهیه بافر(TAE)Tris-Acetate-EDTA………………………………………………………………..61

 

3-20-5- انجام فرایند واکنش زنجیره پلیمراز(PCR)……………………………………………………………………..62

 

3-20-5-2- شرایط واکنش PCR………………………………………………………………………………………………62

 

3-20-5-3- بررسی محصولات PCR………………………………………………………………………………………..63

 

3-20-5-4- خالص سازی محصولات PCR……………………………………………………………………………….63

 

3-20-6- تعیین توالی نوکلئوتیدی قطعات تکثیر شده از ژن 16S rRNA………………………………………….63

 

3-20-7- مقایسه توالی نوکلئوتید ژن 16S rRNA سویه‌های اکتینومایست منتخب…………………………….63

 

فصل چهارم: نتایج                                                                                                       

 

4-1- شرایط پیش تخمیر و تخمیر و میزان متابولیت تولید شده توسط40 سویه  اکتینومیست‌ بررسی شده در این پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………………65

 

4-2- نتایج حاصل از تست ارزیابی سمیت متابولیت‌های ثانویه………………………………………………………..68

 

4-3- نتایج مربوط به بررسی ریخت شناسی سلول‌ها در تست سمیت سلولی………………………………….. 71

 

4-4- نتایج مربوط به تست سمیت سلولی با روش MTT……………………………………………………………….72

 

4-5- بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها پس از تیمار با عصاره سویه‌ی اکتینومیست‌های منتخب………………74

 

4-6- شناسایی اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………………………………..74

 

4-6-1- بررسی ریخت شناسی اکتینومیست‌های منتخب…………………………………………………………………74

 

4-6-3- بررسی فیلوژنتیکی اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………………77

 

4-6-3-1- تائید استخراجDNA اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………77

 

4-6-4- تائید استخراج ژن16S rRNA از ژل آگاروز……………………………………………………………………..77

 

4-6-4-1- نتایج مربوط به توالی خوانی ژن 16S rRNA……………………………………………………………….78

 

 فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری                                                                                      

 

 منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 91

 

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………101

 

پیوست‌ها………………………………………………………………………………………………………………………….102

 

فهرست جداول

 

عنوان                                                                                                                  صفحه

 

جدول ‏1‑1: میزان شیوع و مرگ و میر ناشی از انواع سرطان در هر دو جنس زن ومرد. 25

 

جدول ‏1‑2: تغییرات تنوع سرطان در ایران در طی سال‌های 1376-1318.. 27

 

جدول ‏1‑3:گروه‌های مختلف اکتینومیست‌ها 29

 

جدول ‏1‑4: تعدادی از متابولیت‌های استخراج شده توسط اکتینومیست‌ها 32

 

جدول ‏3‑1:مواد شیمایی استفاده شده 39

 

جدول ‏3‑2:دستگاه‌های استفاده شده 42

 

جدول ‏3‑3:ترکیبات محیط کشت ISP2 اصلاح شده 44

 

جدول ‏3‑4:ترکیبات محیط پیش تخمیر. 45

 

جدول ‏3‑5:نمک‌های مورد نیاز برای تهیه آب نمک دریایی مصنوعی.. 46

 

جدول ‏3‑6:ترکیبات مورد استفاده درتهیه محیط کشت دودمان A549. 49

 

جدول ‏3‑7:ترکیبات محیط کشت… 58

 

جدول ‏4‑1:نتایج حاصل از مرحله ی تولید واستخراج متابولیت‌های ثانویه. 64

 

جدول ‏4‑2:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 40-59% (محدوده اثر خوب). 67

 

جدول ‏4‑3:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 39-20% (محدوده اثر متوسط). 69

 

جدول ‏4‑4:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 0-19% (محدوده اثرضعیف). 70

 

جدول ‏4‑5: نتایج مربوط به بررسی مرفولوژی سلول پس از تیمار با عصاره‌ها 70

 

جدول ‏4‑6: نتایج مربوط به مقایسه مقدار جذب بین عصاره‌ها با شاهد…………………………………………….. 72

 

جدول ‏4‑7: شماره دسترسی در Gene Bank ومیزان تشابه اکتینومیست‌های منتخب با اکتینومیست‌های ثبت شده براساس ترادف نوکلئوتید‌های ژن 16S rRNAدر ژنوم…………………………………………………………… 80

 

فهرست نمودارها

 

عنوان                                                                                                                  صفحه

 

نمودار ‏4‑1:مقایسه میانگین مقدار جذب بین عصاره‌های سویه‌هایی که 05/0≥p داشتندبا شاهد(A549). 73

 

فهرست اشکال                           صفحه

 

شکل ‏1‑1: ساختمان شیمیایی داکتینومایسین.. 12

 

شکل ‏1‑2: ساختمان شیمیایی دانوروبیسین.. 14

 

شکل ‏1‑3: ساختمان شیمیایی دوکسوروبیسین.. 16

 

شکل ‏1‑4: ساختمان شیمیایی میترامایسین.. 17

 

شکل ‏1‑5:ساختمان شیمیایی بلئومایسین.. 18

 

شکل ‏1‑6:ساختمان شیمیایی میتومایسین.. 20

 

شکل ‏1‑7: ساختمان شیمیایی استرپتوزوستین.. 22

 

شکل ‏3‑1: این تصاویر به عنوان نمونه از میزان آسیب می‌باشد که برای درک بهتر هر مفهوم آسیب دیدگی……………………………………………………………………………………………………………………………………….54