1-5-1 پژوهش های صورت گرفته در ایران…………………………………………………………… 12

 

1-5-2 پژوهش های صورت گرفته در دیگر کشور ها………………………………………………. 13

 

1-9 فرضیه های پژوهش…………………………………………………………………………………. 15

 

1-10 اهداف پژوهش……………………………………………………………………………………. 15

 

فصل دوم: مواد و روش ها………………………………………………………………………………. 16

 

2-1 نمونه برداری ………………………………………………………………………………………… 17

 

2-2 روش نمونه برداری ………………………………………………………………………………… 18

 

2-3 مطالعات صورت گرفته ………………………………………………………………………… 19

 

2-3-1 روش شناسایی گونه ………………………………………………………………………….. 19

 

2-3-2 روش اندازه گیری طول گاماروس ها ………………………………………………………….. 20

 

2-3-3 روش اندازه گیری وزن ………………………………………………………………………….. 20

 

2-3-4 روش تشخیص جنسیت گونه ها …………………………………………………………….. 21

 

2-3-5 روش شمارش تعداد تخم ها و نوزادان گاماروس …………………………………………… 26

 

فصل سوم نتایج………………………………………………………………………………………. 28

 

نتایج حاصل از ایستگاه های مختلف ……………………………………………………………….. 30

 

3-1 ایستگاه شماره 1 ( ساحل دانشگاه) …………………………………………………………….. 30

 

3-2 ایستگاه شماره 2 ( ساحل سنگی) …………………………………………………………… 32

 

3-3 ایستگاه شماره 3 ( پارکینگ 1) …………………………………………………………….. 34

 

3-4 ایستگاه شماره 4 ( پارکینگ 3) …………………………………………………………………. 36

 

3-5 ایستگاه شماره 5( پارکینگ 5) …………………………………………………………………. 38

 

3-6 ایستگاه شماره 6( پارکینگ 6) ………………………………………………………………….. 40

 

3-7 ایستگاه شماره 7 ( شازده رودخانه) …………………………………………………………… 42

 

3-8 ایستگاه شماره 8 (دریاکنار) …………………………………………………………………….. 44

 

3-9 ایستگاه شماره 9 ( خزرشهر) ………………………………………………………………….. 46

 

3-10 ایستگاه شماره 10( پارک لاله) …………………………………………………………….. 48

 

3-11 فراوانی گاماروس در ماه ها و ایستگاه های مختلف  …………………………………….. 48

 

3-12 طول و وزن گاماروس ………………………………………………………………………….. 52

 

3-13 رابطه بین طول و وزن گاماروس ……………………………………………………………. 54

 

3-14 توزیع فراوانی گاماروس های جفت شده در  ایستگاها و ماه های مختلف سال……….. 55

 

3-15 هم آوری (تعداد تخم) گاماروس در  ایستگاه ها و ماه های مختلف……………….. 57

 

3-16 توزیع فراوانی نسبت جنسی  گاماروس در  ایستگاه ها و ماه های مختلف …………. 59

 

3-17 توزیع فراوانی نسبی گاماروس های بالغ و نابالغ در ایستگاه ها و ماه های مختلف…… 60

 

3-18 پارامترهای محیطی و همسبتگی آنها با فراوانی گاماروس ……………………………… 61

 

فصل چهارم بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………. 64

 

 

4-1 بحث …………………………………………………………………………………………. 65

 

4-2 نتیجه گیری نهایی ……………………………………………………………………………. 69

 

4-3 پیشنهادات ……………………………………………………………………………………. 69

 

منابع و مآخذ ………………………………………………………………………………………. 71

 

منابع فارسی…………………………………………………………………………………..71

 

منابع انگلیسی………………………………………………………………………………… 73

 

ضمائم……………………………………………………………………………………………. 77

 

Abstract………………………………………………………………………………………… 

 

چکیده:

 

به منظور بررسی تغییرات فصلی پراکنش و تنوع گاماروسها به تفکیک جنسیت در سواحل ، نمونه برداری بصورت فصلی در ده ایستگاه (از بابلسر تا فریدون کنار) به مدت یکسال ازمرداد 1392 لغایت اردیبهشت 1393 با کوادرات 50×50 سانتیمتر بصورت تصادفی و برداشت کامل تمامی نمونه ها در طول سواحل شنی انجام گرفت. در مطالعات صورت گرفته فقط گونه Pontogammarus maeoticus مشاهده شد. میانگین طول در نمونه های نابالغ و جنسهای نر و ماده بترتیب 1/4، 5/8 و 3/8 میلیمتر و وزن بترتیب 0068/0، 0303/0 و 0282/0 گرم برآورد شد، نرها دارای طول و وزن بیشتری از ماده هستند، حداکثر طول نر و ماده در این گونه 14 میلیمتربدست آمد از مجموع 1906 نمونه شمارش شده در آزمایشگاه 673 (30/35 %) نر ، 873 (80/45%) ماده ، 360 (9/18%) نابالغ بدست آمد. نسبت جنسی (نر/ ماده ) در فصل بهار، تابستان، پاییز و زمستان به ترتیب( 63/) ،(93/) ،(21/1) و(70/) بود. بیشترین نسبت جنسی با 21/1 در فصل پاییز (آبان) و کمترین نسبت جنسی با 63/ در فصل بهار(ادیبهشت) مشاهده شد همچنین این نسبت جنسی  با اختلاف کم به نفع ماده ها می باشد.

 

فصل اول: مقدمه

 

1-1- مقدمه

 

دریای خزر یکی از پهنه های آبی بسته جهان به خاطر اهمیت اقتصادی و سیاسی جزء مناطقی است که برای کشورهای ساحلی اطراف آن بسیار با اهمیت است. در گذشته به نامهایی مانند خاواینسکی، دریای هیرکانیان، دریای جرجان (گرگان)، بحر مازندران بحر آبسکون و بحر قانیا خوانده می شد. این دریا دارای سه ناحیه شمالی، میانی، و جنوبی است. که مساحت هر ناحیه به ترتیب عبارتند 91942، 137812 و 118640 کیلومتر مربع است(13). کشورهای روسیه، ترکمنستان، قزاقستان، ایران و جمهوری آذربایجان در حاشیه دریای خزر قراردارند. بیشترین عرض دریای خزر554 کیلومتر و کمترین عرض آن حدود 302 کیلومتر است. طول خطوط ساحلی دریای خزر در قسمت ایرانی حدود 992 کیلومتر است(15). ناحیه خزر جنوبی دارای مساحت حدود 118640 کیلومتر مربع، متوسط حجم آب آن 48300 کیلومتر مکعب، در بر گیرنده 64 % حجم آب خزر است. حداکثر عمق ناحیه جنوبی 1025 متر و متوسط عمق آن 300 متر است. میزان شوری خزرجنوبی 13-10 ppt (آب لب شور)، است. تولید اولیه 41 mil. tons organic carbon/year است. طول خط ساحلی با احتساب جزایر 7000 کیلومتر، بدون احتساب جزایر 5580 کیلومتر است، که ایران 725کیلومتر، آذربایجان 600 کیلومتر، روسیه 755 کیلومتر، قزاقستان 2300کیلومتر ، ترکمنستان 1200کیلو متر است(15).

 

سواحل دریای خزر از نظر ژئو مور فولوژیکی به سواحل شمالی، سواحل شرقی، سواحل غربی و سواحل جنوبی تقسیم میشود. سواحل ایران در قسمت جنوبی دریای خزر قرار دارد که حدود 700کیلومتر را شامل می شود. سواحل ایران را از نظر دانه بندی رسوب، می توان به سه دسته ماسه ای (سواحل گیلان و شرق مازندران) قلوه سنگی (غرب مازندران) و سیلتی – رسی (گلستان) تقسیم بندی کرد اما سواحل جنوبی دریای خزر بیشتر از نوع گلی و ماسه ای است که این حالت باعث میشود بستر حالت سست داشته باشد بنابر این فراوانی و تنوع گونه ای را کاهش می دهد(46). ساحل جنوبی دارای خطوط ساحلی نسبتا مستقیمی است، که بریدگی کمی دارد، دلیل وجود بریدگی کم در سواحل جنوبی خزر، عمق زیاد دریا در این بخش می باشد. حاشیه ساحل در جنوب دریا، از رسوباتی که رودها آن را ایجاد نموده اند و نیز از تپه های ماسه ای تشکیل شده است. ساحل دریا در منطقه مازندران، رسوبی است و از خلیج گرگان به سمت غرب، جلگه ساحلی عریض می شود، به طوری که در شهرستانهای آمل و بابل به حداکثر عرض خود می رسد.

 

2-1- بررسی برخی از فاكتور های محیطی دریای خزر:

 

1-2-1- تغییرات دما در دریای خزر

 

تغییرات دما در بین مناطق شمالی و جنوبی دریای خزر حدود 10درجه سانتیگراد است. بنابر این در زمستان در مناطق شمالی آب یخ می بندد اما در مناطق جنوبی دما حدود 9 درجه سانتیگراد است این اختلاف به علت تفاوت در عرض های جغرافیایی است که پایین ترین حد جنوبی آن عرض جغرافیایی 36درجه و 33دقیقه شمالی و بالاترین حد شمالی آن عرض جغرافیایی 47درجه و 7دقیقه شمالی است(13).

 

2-2-1- تغییرات شوری دریای خزر

 

تغییرات شوری تحت تاثیر آب رودخانه ها و عرض های جغرافیایی مختلف است که باعث تغییر درجه حرارت شده و مقدار شوری این دریا را تغییر می دهد. تغییرات شوری آب دریای خزر در قسمت شمالی بیشتر و درقسمت میانی و جنوبی نوسانات کمتری دارد. متوسط شوری کل آب دریای خزر حدود 13 قسمت در هزار و آب آن لب شور است(13).

 

3-2-1- دریای خزر از نظر اکسیژن

 

تاعمق 1000متری، در قسمت جنوبی، دریای خزر دارای اکسیژن است. و در زمستان آب از اکسیژن اشباع می شود زیرا در فصل زمستان فیتو پلانکتون ها همچنان به فعالیت خود ادامه می دهند. در فصل تابستان به علت فر آیندهای اکسیدی میزان اکسیژن کم می شود، اما چون پدیده ترمو کلاین بیشتر مواقع اتفاق می افتد، میزان اکسیژن دوباره افزایش می یابد، بنابر این قسمت جنوبی دریای خزر محیط مناسبی برای پلانکتون ها و جانداران دریایی است(13).

 

3-1- ناجور پایان

 

ناجور پایان گروهی ازسخت پوستان آبزی، به دلایل زیر در این پژوهش به عنوان الگو قرار گرفتند:

 

1- راحت بودن دسترسی به آنها

 

2- نقش آنها در غذای ماهی ها

 

3- نقش آنها به عنوان شاخص آلودگی آب 

 

4- میزبان حد واسط برای انگلهای بسیاری از ماهی ها، پرندگان، و دوزیستان

 

جنس گاماروس به عنوان اعضای غالب دراکوسیستمهای آب شیرین، لب شور و دریایی محسوب می شود و نقش کلیدی درساختار و عملکرد جوامع آبزی دارد. همچنین گاماروسها به عنوان یک عضو انتقال کربن در زنجیره موادغذایی محسوب میشوند. در سواحل ایران گونه ی  Pontogammarus maeoticus  به عنوان گونه غالب دریا خزر است. در دریای خزر، 9 راسته ازسخت پوستان شناخته شده است، که شامل 5 خانواده و 16 جنس می باشند این 16 جنس نقش مهمی در زنجیره غذایی تاسماهیان، شاه‌ماهى‌، ماهى‌، قزل‌الا و بسیاری از پرندگان مختلف ازجمله فلامینگو و پاشله دارد(30).

 

نام  Amphipodaاز دو کلمه ) amph ازواژه یونانی amphi=amphisبه معنای دوتا، دوجور، جدا) و کلمه pod (از واژه یونانی podos یا pous به معنی پا) تشکیل شده است و به معنی پاهای دو جور یا متفاوت است (37). از تیره های بزرگ راسته دو جور پایان می توان سخت پوستان تیره گاماریده را نام برد، گاماریده ها جزء زیر راسته سخت پوستان عالی هستند و از مواد آلی و اجساد موجودات زنده تغذیه می کنند بنابراین می توانند نقش موثری در پاکیزگی محیط زیست داشته باشند این موجودات می توانند غذای موجودات آبزی نیزباشند، بیشتر آنها در دریا  ها و اقیانوسها و تعداد کمی نیز در آبهای شیرین زندگی می کنند (1). ناجور پایان دارای پراکندگی گستر ده ای در دنیا هستند تا به حال حدود 4300 گونه از آنها را در قسمت های مختلف دنیا شناسایی کرده اند. پراکندگی زیادی  در نواحی ساحلی و بخش های عمیق دریاها و اقیانوسها و حتی آبهای شیرین نهر ها و رودخانه ها و دریاچه ها دارند. در رودخانه های سواحل جنوبی ایران در مناطقی که آب زلال و شفاف باشد بطور گسترده وجود دارند(1). ناجور پایان نقش قابل توجهی دراکوسیستمهای آب شیرین ودیگر اکوسیستمهای آبی داخلی دارند وحساسیت زیادی نسبت به تخریب محیط زیست ازخودنشان می دهند(26).

 

 

فصل سوم: مواد و روشها

 

1-3- موادو روشها————- 25

 

2-3- تهیه عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه—- 27

 

3-3- حیوانات آزمایشگاهی—— 28

 

1-3-3- نحوه گروهبندی:——- 28

 

2-3-3- روش القای دیابت تجربی:—————- 29

 

3-3-3- اندازه گیری قند و وزن موشها:———— 29

 

4-3-3- مراحل انجام تشریح:—- 29

 

4-3- بررسی بیان ژن———- 31

 

1-4-3- مشخصات توالی ژن PFK-1————- 31

 

2-4-3- طراحی پرایمرها——- 35

 

3-4-3- آماده سازی پرایمر—– 35

 

5-3- استخراج RNA:———- 36

 

1-5-3- استخراج RNA از نمونه های تازه کبد توسط کیت Geneall Hybrid Rtm

 

1-5-3- بررسی کمیت و کیفیت RNA  استخراج شدهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 38

 

6-3- سنتز cDNA————

 

1-6-3- سنتز cDNA توسط کیتThermo SCIENTIFICبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—-

 

7-3- واکنش های PCR——–

 

1-7-3 – PCR شیب دمایی—– 41

 

2-7-3- PCR معمولی——— 43

 

8-3- الکترفورز————— 45

 

1-8-3 – مواد مورد نیازجهت تهیه ژل الکتروفورز—- 45

 

1-1-8-3- آگارز————– 45

 

2-1-8-3- اتیدیوم بروماید—— 46

 

3-1-8-3- لودینگ بافر——— 46

 

4-1-8-3-طرز تهیه محلول Tris-Hcl————-

 

4-1-8-3- شناساگرهای اندازهDNA————–

 

9-3- روش کار با ژل الکترفورز— 47

 

10-3- رسم منحنی استاندارد:— 48

 

10-3- واکنش Real-Time PCR—————-

 

11-3- Threshold و مقدار CT:–

 

12-3- تعیین توالی محصولات  (Direct Sequencing) PCRبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———

 

10-2-3- آنالیز بیان ژن——– 52

 

13-3- تجزیه وتحلیل داده ها—- 52

 

 

فصل چهارم: نتایج و بحث

 

1-4- جمع آوری نمونه :——– 54

 

2-4- بررسی نتایج وزن موشهای مورد مطالعه——- 54

 

3-4- بررسی نتایج گلوکز ناشتای سرم موشهای مورد مطالعهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———- 56

 

5-4- نتایج استخراج RNA:—–

 

6-4- نتایج حاصل ازساخت cDNA بر روی ژل آگاروزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————— 59

 

7-4-  نتایج تعیین غلظت و کیفیت RNA توسط اسپکتروفتومتریبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 61

 

1-7-4-  نتایج مربوط به PCR شیب دمایی——– 61

 

8-4- نتایج منحنی استاندارد—- 62

 

1-8-4- منحنی استاندارد ژن TBP—————

 

2-8-4-منحنی استاندارد ژن PFK-1————-

 

9-4- نتایج واكنش  Real Time PCR————-

 

1-9-4- تکثیر ژنPFK———

 

2-9-4-تکثیر ژن TBP———

 

10-4- ارزیابی  کارایی تکثیر ژنهای مور مطالعه از طریق آنالیز منحنی ذوب:—— 66

 

1-10-4- منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن  PFKبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———–

 

2-10-4-منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن TBPبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————-

 

11-4-  آنالیز منحنی ذوب ژن PFK————–

 

12-4-آنالیز منحنی ذوب ژن TBP—————

 

13-4- نتایج حاصل از Real timePCR ژن PFK 1 بر روی ژل آگارزبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد— 70

 

14-4- نتایج بررسی بیان ژن PK—————- 70

 

15-4- بحث:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 71

 

16-4- پیشنهادات————- 73

 

منابع:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 75

 

چکیده:

 

دیابت قندی یكی از مشكلات مهم پزشكی در همه كشورها می‌باشد. امروزه، درد و رنج انسان نه تنها در مورد این بیماری به خودی خود، بلکه شامل عوارض مرتبط با دیابت است.  گیاهان نشان دهنده منبع عظیمی از مکمل­های غذایی بالقوه مفید برای بهبود کنترل قند خون و جلوگیری از عوارض دراز مدت دیابت هستند. با توجه به تنوع گیاهان داروئی در ایران و با توجه به پتانسیل درمانی گیاهان داروئی و همچنین خطراتی كه داروهای شیمیایی ممكن است در حال حاضر یا آینده برای بیماران ایجاد كنند، با بررسی تاثیر گیاهان دارویی در بیماری دیابت می­توان راه­های درمان مناسبی در پیش رو قرار داد.آنزیم  فسفو فروکتوکیناز -1 از آنزیمهای سیتوزولی در مسیر گلیکولیز می باشد که نقش کلیدی در روند تنظیم گلیکولیز دارد.عوارض ناشی از نقص موروثی آنزیم pfk-1 در عضلات اسکلتی بصورت خستگی و کاهش توان حرکات عضلانی می باشد. در مواردی هم نقص آن باعث رشدسریع سلولهای سرطانی می شود. درتحقیق حاضر به  تاثیر عصاره هیدر الکلی برگ گیاه جغجغه (با توجه به دارا بودن اثرات ضدالتهابی، ضد میکروبی و ضد دیابتی ) بر بیان ژن pfk-1در موشهای دیابتی نوع 1می پردازیم.

 

در این مطالعه 45 سر موش صحرایی نر به طور تصادفی در سه گروه شاهد سالم، شاهد دیابتی و دیابتی تحت تیمار تجویز عصاره جغجغه تقسیم شدند. با تزریق استرپتوزوتوسین (mg/kg 60) در موش­های صحرایی نر (300-150 گرم) دیابت نوع 1 ایجاد شد.گروه دیابتی تحت تیمار به صورت روزانه (mg/kg 300) عصاره برگ گیاه جغجغه را به صورت گاواژ به مدت 30 روز دریافت نمودند. گروه شاهد سالم و شاهد دیابتی آب مقطر دریافت کردند. سپس در روز قبل از تجویز عصاره و روزهای 15 و 30 بعد از تجویز عصاره میزان گلوکز خون اندازه­گیری شد و بیان ژن PFK-1 بافت کبدی توسط روش Real-Time PCR بررسی گردید. نتایج نشان داد گلوکز خون در روز 15کاهش می یابد اما بین گروه شاهد دیابتی و دیابتی تحت تیمار تفاوت معنی داری مشاهده نشد میزان بیان ژن PFK در گروه دیابتی تحت تیمار در روز 15 تفاوت معنی داری نسبت به شاهد دیابتی ندارد در بین گروهها تفاوت معنی داری برای بیان ژنPFK  وجود ندارد. بنابراین تجویز عصاره هیدروالکی گیاه جغجغه بر بیان ژن فسفوفروکتوکیناز -1 در بیماران دیابتی نوع 1 بی تاثیر می باشد.

 

فصل اول: مقدمه و کلیات

 

1-1- مقدمه

 

دیابت یک بیماری ساده نیست، بلکه سندرم پیچیده­ای است که بارزترین ویژگی آن افزایش قند خون است. بنابراین، بیماران دیابتی هر چند در یک ویژگی به هم می­مانند، اما هم از نظر بالینی و هم از نظر آسیب شناسی و ژنتیکی ناهمگون هستند. این بیماری در سال 1980 میلادی این گونه تعریف شد: گروهی از نارسایی­ها که ویژگی اصلی آن­ها افزایش بیش از اندازه­ی گلوکز در خون و کاهش تحمل به گلوکز است و پیامد کمبود انسولین یا نارسایی در کارکرد انسولین و یا آمیزه­ای از این دو است. عوارض ناشی از دیابت در 25% موارد، نارسایی کلیه و در 50% موارد قطع عضو و نابینایی است (Tehranipour et al., 2008). گیاهان دارویی از قدیم به منظور کنترل قند خون، کاهش عوارض، افزایش کیفیت و طول زندگی در افراد دیابتی به کار گرفته شده است. با توجه به این که گیاهان دارویی نسبت به داروهای شیمیایی اثر جانبی کمتری دارند، بنابراین پژوهشگران به دنبال یافتن ترکیبهای گیاهی برای درمان و یا پیشگیری از این بیماری هستند. گیاه جغجغه (Prosopis farcta) گیاهی با خواص ضد التهاب و ضد دیابتی است. اهمیت فعالیت فسفوفروکتوکیناز 1 نه تنها از این جنبه است که واکنشی به شدت انرژی زا را کنترل می کند بلکه اولین مرحله در واکنش­های گلیکولایزیز است که واکنش یکطرفه بوده و برگشت ناپذیر است. این باعث می­گردد که کنترل شدیدی بر روی میزان گلوکز و دیگر مونوساکاریدها مانند گالاکتوز و فروکتوز بوجود آید.. هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر میزان بیان ژن پیروات کیناز و کاهش سطح گلوکز خون در موش‌های صحرایی نر دیابتی می‌باشد.

 

 

1-13) ماکرولیدها………………………………………………………………………………27

 

1-14) اریترومایسین، ساختمان و ویژگی ها…………………………………………………30

 

1-15) تاریخچه تولید اریترومایسین………………………………………………………….31

 

1-16) نام ها و فرمول شیمیایی اریترومایسین……………………………………………32

 

1-17) مکانیسم عمل اریترومایسین………………………………………………………..32

 

1-18) فعالیت ضد میکروبی اریترومایسین…………………………………………………33

 

1-19) فارماکوکینتیک………………………………………………………………………….34

 

1-20) مصارف بالینی اریترومایسین………………………………………………………….34

 

1-21) عوارض جانبی اریترومایسین………………………………………………………….35

 

1-22) اشکال دارویی اریترومایسین…………………………………………………………..36

 

1-23) آنتی بیوتیک های مشتق شده از اریترومایسین…………………………………..36

 

1-24) مراحل کلیدی فرآیند تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین……………….38

 

1-24-1) حفظ و نگهداری کشت فعال…………………………………………………………39

 

1-24-2) تهیه مایه تلقیح به فرم سوسپانسیون اسپوری و توسعه آن…………………..44

 

1-24-3) مرحله پیش کشت یا بذردهی یا seeding …………………………………….

 

1-24-4) مرحله تخمیر یا Fermentation ………………………………………………….

 

1-24-4-1) تکنولوژی تخمیر آنتی بیوتیک……………………………………………………..48

 

1-24-4-1-1) تخمیر شیک فلاسک……………………………………………………………….48

 

1-24-4-1-2) فرمانتورهای همزن دار………………………………………………………….49

 

1-24-4-2) بررسی تأثیر عوامل مختلف برروی تخمیر و تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین…50

 

1-24-4-2-1) تأثیر محیط کشت تخمیر و ترکیبات مورد استفاده در آن………………………50

 

1-24-4-2-1-1) منابع کربنی………………………………………………………………………51

 

1-24-4-2-1-2) منابع نیتروژنی…………………………………………………………………..55

 

1-24-4-2-1-3) آب…………………………………………………………………………………57

 

1-24-4-2-1-4) مواد معدنی……………………………………………………………………..57

 

1-24-4-2-1-5) مواد مغذی پیچیده………………………………………………………………59

 

1-24-4-2-1-6) ویتامین ها و فاکتورهای رشد…………………………………………………..61

 

1-24-4-2-1-7) پیش ماده ها……………………………………………………………………..61

 

1-24-4-2-1-8) القا کننده ها و تحریک کننده ها……………………………………………….61

 

1-24-4-2-2) تأثیر pH……………………………………………………………………………..

 

1-24-4-2-3) تأثیر دما……………………………………………………………………………..64

 

1-24-4-2-4) تأثیر هوادهی………………………………………………………………………..67

 

1-24-4-2-5) تأثیر هم زدن………………………………………………………………………..68

 

1-24-4-2-6) تأثیر دی اکسید کربن……………………………………………………………..71

 

1-24-4-2-7) تأثیر کف…………………………………………………………………………….71

 

1-24-4-2-8) تأثیر استریلیزاسیون……………………………………………………………….73

 

1-24-4-2-9) تأثیر ویسکوزیته…………………………………………………………………..74

 

1-24-4-2-10) تأثیراریترومایسین تولید شده…………………………………………………..76

 

1-24-5) برداشت و خالص سازی محصول………………………………………………………77

 

1-25) سویا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی………………………………..79

 

 

1-25-1) علل انتخاب سویا و توسعه کشت آن…………………………………………………..79

 

1-25-2) تاریخچه سویا…………………………………………………………………………….80

 

1-25-3) تولید و مصرف جهانی سویا………………………………………………………………81

 

1-25-4) سویا در ایران……………………………………………………………………………82

 

1-25-5) اجزای ترکیبی سویا……………………………………………………………………..82

 

1-25-6) کنجاله سویا………………………………………………………………………………83

 

1-26) کلزا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی………………………………..83

 

1-26-1) علل عمده انتخاب کلزا و توسعه کشت آن…………………………………………….84

 

1-26-2) تاریخچه کلزا……………………………………………………………………………..85

 

1-26-3) تولید جهانی کلزا…………………………………………………………………………86

 

1-26-4) اجزای ترکیبی کلزا………………………………………………………………….86

 

فصل دوم : مروری بر متون گذشته

 

2-1) پیشینه پژوهش……………………………………………………………………………88

 

فصل سوم : مواد و روش ها

 

3-1) روش گردآوری اطلاعات و انجام پژوهش…………………………………………………..93

 

3-2) سویه باکتری مورد استفاده در پژوهش…………………………………………………..93

 

3-3) معرفی رنگ های مورد استفاده…………………………………………………………….94

 

3-4) محیط های کشت مورد استفاده…………………………………………………………..95

 

3-4-1) محیط کشت اسپورزایی………………………………………………………………….95

 

3-4-1-1) تهیه سوسپانسیون اسپوری…………………………………………………………98

 

3-4-2) محیط کشت مرحله بذردهی( پیش کشت_ seeding)……………………………….99

 

3-4-2-1) انتخاب بهترین ارلن در مرحله بذردهی…………………………………………….100

 

3-4-3) محیط کشت مرحله تخمیر………………………………………………………………104

 

3-4-3-1) غلظت های کنجاله سویا و کنجاله کلزا مورد استفاده شده در محیط تخمیر…….105

 

3-5) نمونه گیری…………………………………………………………………………………..106

 

3-6) سنجش اریترومایسین تولید شده………………………………………………………106

 

3-6-1) تهیه بافر کربنات بی کربنات با pH 6/9 ……………………………………………..

 

3-6-2) تهیه بافر با pH 6/9 اشباع از کلروفرم و کلروفرم اشباع از بافرpH 6/9 …………….

 

3-6-3) تهیه بافر سیترات_فسفات با pH 2/4………………………………………………

 

3-6-4) تهیه محلول بروموفنل بلو…………………………………………………………….108

 

3-6-5) تهیه محلول های استاندارد اریترومایسین………………………………………….109

 

3-6-6) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر با استفاده از کلروفرم…………………….111

 

3-6-7) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو……………………………112

 

3-6-8) اندازه گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو…………113

 

3-7) محیط کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین…………………………..113

 

3-7-1) محیط کشت مولر هینتون آگار………………………………………………………113

 

3-7-2) محیط کشت مولر هینتون براث…………………………………………………….114

 

3-7-3) استخراج اریترومایسین از محیط کشت تخمیر……………………………………..114

 

3-7-4) سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین………………………………………………..114

 

3-7-5) تهیه مایع تلقیح…………………………………………………………………………115

 

3-7-6) تهیه چاهک………………………………………………………………………………116

 

3-7-7) تهیه بافر فسفات با pH 8……………………………………………………………..

 

3-7-8) تهیه محلول های استاندارد…………………………………………………………..116

 

3-7-9) افزودن محلول های آنتی بیوتیک در پلیت ها……………………………………….117

 

3-7-10) اندازه گیری قطر هاله مهار رشد………………………………………………..117

 

3-7-11) رسم منحنی استاندارد………………………………………………………………117

 

3-8) سنجش غلظت اریترومایسین به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا…………….118

 

3-8-1) فاز متحرک………………………………………………………………………………..118

 

3-8-2) آماده سازی مایع تخمیر…………………………………………………………………118

 

3-8-3) اندازه گیری مقداراریترومایسین…………………………………………………………119

 

3-9) کروماتوگرافی لایه نازک TLC ……………………………………………………………..

 

فصل چهارم: نتایج پژوهش

 

4-1) بررسی اثر کنجاله سویا بر رشدSaccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین (محیط شاهد)…123

 

4-1-1) اثر کنجاله سویا در pH محیط کشت تولید اریترومایسین (کنترل)…………………….123

 

4-1-2) اثر کنجاله سویا بر درصد بیومس تولید شده (کنترل)……………………………….124

 

4-1-3) اثر کنجاله سویا در میزان تولید اریترومایسین ( کنترل)………………………………125

 

4-1-4) بررسی اثر کنجاله سویا بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea (کنترل)…125

 

4-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر تولید اریترومایسین…………………128

 

4-2-1) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر pH محیط کشت……………………129

 

4-2-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر بیومس تولیدی……………………130

 

4-2-3) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر میزان اریترومایسین تولیدی……….130

 

4-3) غلظت بهینه ترکیب کنجاله سویا و کلزا برای محیط کشت تولید اریترومایسین…………131

 

4-4) اثر ترکیب کنجاله سویا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر و کنجاله کلزا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر بر روی پارامترهای مورد بررسی درتخمیر………32

 

4-4-1) بررسی اثر غلظت بهینه در میزان تولید اریترومایسین………………………………….132

 

4-4-2) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی pH محیط کشت تخمیر……………………………….133

 

4-4-3) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی درصد بیومس تولیدی………………………………..133

 

4-4-4) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea………

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

 

5-1) تأثیر مواد تشکیل دهنده و ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک…137

 

5-1-1) اثر منابع نیتروژنی در تولید اریترومایسین…………………………………………………..137

 

5-1-1-1) مقایسه اثر غلظت های مختلف ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا به عنوان منبع نیتروژنی در تولید اریترومایسین…..138

 

5-2) همزمانی رشد Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین………………….144

 

5-3) رابطه بین میزان رشد باکتری و تغییرات بیومس در طول فرآیند……………………………145

 

5-3-1) سینتیک رشد میکروبی……………………………………………………………………..146

 

5-4) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده در این پژوهش و pH محیط کشت تخمیر………148

 

5-5) رابطه بین مورفولوژی سویه مولد و تولید اریترومایسین………………………………….149

 

5-6) برآورد هزینه ها………………………………………………………………………………..153

 

5-6-1) محاسبه میزان اریترومایسین تولیدی و قیمت تمام شده منبع نیتروژنی مورد استفاده در آن در هر Batch صنعتی….153 

 

5-6-1-1) استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا (محیط کنترل) در تخمیر……………………154

 

5-6-1-2) استفاده از ترکیب 15 گرم در لیتر کنجاله سویا و 15 گرم در لیتر کنجاله کلزا……..154

 

5-7) پیشنهادات………………………………………………………………………………………156

 

منابع و مراجع……………………………………………………………………………………..158

 

خلاصه انگلیسی………………………………………………………………………………….165

 

ضمائم ……………………………………………………………………………………………..166

 

چکیده:

 

امروزه یکی از مهم ترین و پرمصرفترین آنتی بیوتیک های مورد استفاده اریترومایسین می باشد که در درمان طیف وسیعی از بیماری ها مورد استفاده قرار می گیرد. برای تولید این آنتی بیوتیک پنج مرحله کلیدی وجود دارد که از بین این مراحل، مهم ترین و پر هزینه ترین مرحله که در آن اریترومایسین تولید می شود مرحله تخمیر است. ترکیبات محیط کشت مرحله تخمیر  نقش مهمی را در میزان تولید محصولات ثانویه و  پارامترهای تخمیر ایفا می کنند همچنین سوبسترای نیتروژنی یکی از اجزای اصلی محیط کشت در این مرحله و یکی از موارد اصلی هزینه در مخلوط محیط کشت می باشد. بنابراین استفاده از منابع نیتروژنی با قیمت مناسب و بازده قابل قبول از اهمیت ویژه ای برخوردار است . در این پژوهش اثرغلظتهای مختلف ترکیبی از دو منبع نیتروژنی کنجاله سویا و کنجاله کلزا در تولید آنتی بیوتیک اریترومایسین بررسی شده است. برای تولید اریترومایسین از باکتری رشته ای Saccharopolyspora erythraea   استفاده شده است. سوسپانسیون اسپوری به محیط بذردهی تلقیح شده و در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 40 تا 44 ساعت با دور rpm 200 در شرایط هوازی گرما گذاری شد و بهترین نمونه بذردهی به ارلن های حاوی محیط تخمیر اضافه شد و با pH اولیه 8/6 در شیکر انکوباتوردار با دمای 33 درجه سانتیگراد و دور rpm220 به مدت 11 روز گرما گذاری شد. در طول فرایند تغییرات مورفولوژیک باکتری ، pH ، درصد وزن تر بیومس تولیدی از روز چهارم به صورت یک درمیان اندازه گیری شد . میزان اریترومایسین تولید شده به روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد . غلظت های منابع نیتروژنی مورد استفاده عبارت بود از :

 

1- کنجاله سویا 15 گرم در لیتر و کنجاله کلزا 15 گرم در لیتر ( هر کدام 50 % محیط )

 

2- کنجاله سویا 18 گرم در لیتر ( 60 % ) و کلزا 12 گرم در لیتر ( 40 % )

 

3- کنجاله سویا 12 گرم در لیتر ( 40 % ) و کلزا 18 گرم در لیتر ( 60 % )

 

4-کنجاله سویا 21 گرم در لیتر ( 70 % ) و کلزا 9 گرم در لیتر ( 30 % )

 

5- کنجاله سویا 9 گرم در لیتر ( 30 % ) و کلزا 21 گرم در لیتر ( 70 % )

 

 بر طبق نتایج بدست آمده، استفاده از مخلوط 15 گرم در لیتر کنجاله سویا و 15 گرم در لیتر کنجاله کلزا ،دارای بالاترین میزان تولید اریترومایسین بوده و نسبت به استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا که حالت مورد استفاده در صنعت می باشد 011/1 برابر اریترومایسین بیشتری تولید نموده است.

 

مقدمه:

 

بیوتکنولوژی دانشی است که در رابطه با استفاده از موجودات و یا متابولیت های آنها جهت تولید فرآورده های مختلف دارویی ، غذایی ، شیمیایی و غیره در مقیاس صنعتی بحت می کند. روند تکاملی بیو تکنولوژی در طی هزاران سال شکل گرفته و نهایتا به علمی تبدیل شد که با جهت گیری کاربردی میکروبیولوژی و بیو شیمیایی ، ارتباط نزدیکی با مهندسی شیمی ایجاد نموده است ( 48 ).

 

بین انسانها و میکرو ارگانیسمها ، از ابتدا ارتباط حیاتی بسیار نزدیکی وجود داشته که این ارتباط می تواند مضر و یا مفید باشد. پس از آنکه رابرت کخ در سال 1880 برای اولین بار کشت خالص باکتری ها را به دست آورد ، توجه زیادی به عوامل بیماری زا شد و مطالعات بعدی نشان داد که با وجود این که برخی میکروبها عامل بیماری در انسان ، حیوان و گیاه هستند ، عده زیاد دیگری کاربرد صنعتی داشته و در تولید مواد غذایی، داروها ، آنزیم ها ، اسید های آمینه و غیره نقش دارند(52).

 

در دهه 1940 و 1950 که آنتی بیوتیکهای اولیه نظیر پنی سیلین کاربرد بالینی پیدا کرده و به عنوان داروهای ایجازگر شناخته شده بودند ، با از بین بردن بسیاری از باکتری ها عامل وخیم ترین بیماری های عفونی انسان ، جان میلیونها تن حفظ شد. اما مدتی پس از کشف آنتی بیوتیک ها ، به دلایل متعدد، از جمله استفاده نادرست و یا بیش از حد از آنها ، مثلا استفاده تنها جهت فربه کردن دام ، سویه های میکرو ارگانیسم در مقابل آنتی بیوتیک ها مقاوم شدند ، بطوریکه امروزه مجددا بیماری های عفونی ناشی از میکرو ارگانیسم ها تهدیدی جدی برای سلامتی در دنیا محسوب شده و هزینه های بسیار زیادی برای درمان آنها مصرف می شود.

 

طی سالهای 1925 تا 1965 استفاده از میکروبها در صنایع دارویی به صورت یک تحول اساسی زمینه را برای بکارگیری میکروارگانیسمها در تولید داروها و بویژه آنتی بیوتیکها فراهم ساخت و با گذشت زمان این روند تکامل یافت به طوری که امروزه بیو تکنولوژی در حال ورود به مرحله جدیدی است و به عنوان یک علم در عصر پیدایش و ساخت آنتی بیوتیکها توسعه چشم گیری داشته و در حال حاضر تولید انبوه فرآورده های میکروبی نظیر  آنتی بیو تیک ها  به صنعت چند میلیارد دلاری مبدل شده و از نقطه نظر اقتصادی ، آنتی بیوتیکها مهم ترین فراورده های صنعتی دنیای میکروبها محسوب می شوند(12).  بدین ترتیب بالا بردن راندمان تولید و اقتصادی تر کردن فرآیند تولید آنتی بیوتیک ها جز اهداف ضروری است که با تلاش متخصصین در شاخه های مختلف علوم نظیر میکرو بیو لوژی ، بیو شیمی، مهندسی شیمی،بیوتکنولوژی و غیره می توان به آن دست یافت. در صنعت بیوتکنولوژی برای تولید محصولاتی نظیر آنتی بیوتیک ها دو بخش عمده وجود دارد :

 

1- عملیات بالا دستی(Up stream ) : که شامل دو بخش توسعه سویه و توسعه محیط کشت و تخمیر است و در این بخش ها نقش مهندسی شیمی و میکروبیولوژیست حائز اهمیت است. هدف از بخش توسعه سویه ، شناخت، تهیه و تثبیت میکروارگانیسم مولد محصول و هدف از بخش توسعه محیط کشت ، بهینه سازی محیط کشت از نظر میزان و نوع مواد، شرایط تولید و اقتصادی تر نمودن فرآیند می باشد.

 

2- عملیات پایین دستی( D. stream) : در این بخش که در واقع فرآوری پس از تخمیر است، نقش مهندسان در جهت دهی فرآیند تخمیر به سمت نتایج بسیار مهم می باشد. هدف از این مرحله، جداسازی و خالص سازی محصول می باشد. ( 17)

 

فصل اول: کلیات

 

 

1-7 ضرورت اهداف تحقیق………………………………………………………… 33

 

فصل دوم: مواد و روش­ها…………………………………………………………… 35

 

2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی……………………………………….. 36

 

2-2 جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ…36

 

2-2-1 طرز تهیه محیط کشت a-MEM…………………………………………….

 

2-2-2 طرز تهیهPBS   فاقد كلسیم و منیزیم (2/7 : PH)………………………. 37

 

2-2-3 طرز تهیه تریپسین/ EDTA…………………………………………………

 

2-2-4 روش جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان……………… 39

 

2-2-5 پاساژ سلولی……………………………………………………………… 39

 

2-3 تأیید هویت سلول‌های استرومایی به روش ایمونوسیتوشیمی………. 39

 

2-3-1 ایمونوسیتوشیمی CD71………………………………………………..

 

2-3-1-1 طرز تهیه پارافرمالدئید 4%…………………………………………….. 41

 

2-3-1-2 طرز تهیه ژلاتین 1/0 درصد…………………………………………….. 41

 

2-3-1-3 ساخت سرم بز 10%…………………………………………………… 41

 

2-3-1-4 طرز تهیه PBS  ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH)……………….. 42

 

2-3-1-5 طرز تهیه بافر گلیسرول………………………………………………….. 42

 

2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز………………………………………………. 43

 

2-4بررسی مارکر عصبی  βIII-tubulin در سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان  به روش ایمونوسیتوشیمی….44

 

 2-5 تایید هویت عصبی نوروسفر­ها به روش ایمونوسیتوشیمی…………… 45

 

2-6 بررسی مولكولی بیان ژن­های اعضای خانواده نوروتروفین……………….. 46

 

2-6-1 استخراج RNA كل از سلول‌های كشت شده …………………………..46

 

2-6-2بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده…………………………….. 48

 

2-6-3 الكتروفورز ژل آگارز …………………………………………………………49

 

2-6-4 واکنش ساخت cDNA (واکنش رونویسی معکوسRT-)……………… 52

 

2-6-5 انتخاب پرایمر……………………………………………………………… 53

 

2-6-6 آماده‌سازی پرایمرها……………………………………………………… 54

 

2-6-7 واكنش PCR……………………………………………………………….

 

2-7 آنالیز آماری………………………………………………………………….. 58

 

فصل سوم: نتایج…………………………………………………………………. 59

 

3-1 مشاهده مورفولوژی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت….59

 

3-2 تعیین هویت سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز….60

 

3-3 ویژگی­های مورفولوژیکی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت….60

 

3-4 تأیید هویت سلول‌های عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی….60

 

3-5 تأیید هویت نوروسفر­ها با استفاده از نشانگر نستین……………….. 61

 

 

3-6 ارزیابی بیان ژن­های فاكتورهای نوروتروفیك و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باند­ها و نمودار­های مربوط به آن…61

 

4-1 نتیجه ­گیری و بحث………………………………………………………… 70

 

4-1 مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آن­ها…71

 

4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلول­های بنیادی مزانشیمی…72

 

4-3 پتانسیل تمایز سلول­های بنیادی مغز استخوان به سلول­های عصبی……74

 

4-4 تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مغز استخوان در كشت طولانی مدت….76

 

4-5 نتیجه گیری…………………………………………………………………… 77

 

پیشنهادات…………………………………………………………………………. 77

 

مراجع ………………………………………………………………………………..79

 

چکیده:

 

هدف : هدف ما در این پژوهش پاسخ به این سوال است که  آیا MSCs  بعد از کشت طولانی مدت می­توانند به طورخود­بخودی به سلول­های پیش­ساز عصبی تمایز یابند.

 

مواد وروش­ها: این تحقیق شامل دو گروه می­باشد: کشت پاساژ پنجم MSCs  در محیط کشت -MEMα و  FBS %10  به مدت سه هفته بدون تعویض محیط یا استفاده از  القاگر به عنوان گروه آزمایشی و پاساژ پنجم MSCs بدون کشت طولانی مدت به عنوان گروه کنترل. سپس هر گروه توسط واکنش زنجیره­­ای پلیمراز(RT- PCR) به منظور بیان ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک ( NGF، BDNF، NT3، NT4/5و GDNF) و ژن­های نورونی (Nestin،TH  وNurr1) ارزیابی شد. در این مطالعه، از ایمینوسیتوشیمی Nestin و βІІІ-tubulin  به منظور تعیین سلول­هایی که این نشانگر­ها را بیان می­کنند استفاده شد.

 

نتایج: پاساژ پنجم MSCs که از موش صحرایی بالغ استخراج شدند، بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) قادرند بطور خودبخودی به سلول­های شبه نوروسفری تمایز یابند و به نشانگر نستین پاسخ مثبت می­دهند. بعد از هفته دوم کشت، سلول­های شبه نورونی به نشانگر  βІІІ-tubulin واکنش مثبت نشان دادند. بررسی­های آماری نشان داده است که  MSCs در گروه آزمایشی افزایش معنی­داری از ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک  NGF و  GDNFو ژن­های نورونی  Nestinو Nurr1 را نسبت به گروه کنترل نشان دادند    .(p<0.05)  

 

نتیجه گیری:  در این مطالعه نشان داده شد که MSCs در کشت طولانی مدت، به طورخودبخودی به نوروسفر تمایز پیدا می­کنند بدون اینکه با فاکتور رشد یا القا­کننده خاص همراه شوند و قادرند ژن­های اختصاصی نورون­های دوپامینرژیک مانند  THو Nurr1را بیان کنند. مطالعات ما نشان می­دهد که  MSCsدر شرایط کشت طولانی مدت توانایی تمایز به سلول­های نورونی را به طور خودبخودی دارا هستند و پیشنهاد می­شود منبع سلولی مناسبی در درمان بیماری­های نورولوژیکی باشند.

 

فصل اول: مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته

 

مقدمه:

 

امروزه تحقیق بر روی سلول­های بنیادی به دانش پیشرفته­ای تبدیل شده است که نه تنها در حیات علمی، بلکه در بعد اقتصادی نیز موثر قلمداد می­شود ]1[. سال­هاست که این تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسیم سلولی آیا می­توان درمان را بر پایه این سلول­ها بنا نهاد. این تفکر و تحقیق به تدریج به طرف طب جدیدی سوق داده می­شود که از آن به عنوان reparative (regenerative) medicine نام برده می­شود] 2[. پر واضح است برای رسیدن به این هدف، درک کامل بیولوژی سلولی و ماهیت سلول­های بنیادی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. خصوصا” علی­رغم تحقیقات وسیع، هنوز ابهامات متعددی پیرامون نحوه عملکرد سلول­های بنیادی وجود دارد ]3[.

 

سلول­های بنیادی، سلول­های زایای غیر بالغ­اند که قادر به خود تکثیری (Self-renewal) هستند و از این طریق جمعیت سلولی خود را حفظ می­کنند]4[. هر سلول بنیادی در کنام یا نیچ تنظیمی خود قرار گرفته است. کنام یک سلول، مجموعه­ای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلول­های بنیادی، تنظیم توازن بین خود نوزایی و تمایز است. یکی از مکانیسم­های تنظیم کننده این توازن کنترل تقسیم متقارن و نامتقارن می­باشد. در تقسیم نامتقارن، از تقسیم سلول ­بنیادی دو سلول دختری ایجاد می­گردد که یکی در کنام باقی مانده و دیگری کنام را ترک کرده تا تعداد زیادی پیش­ ساز ایجاد نماید و در نهایت به سلول­های بالغ تمایز پیدا می­کنند. در عوض در تقسیم متقارن، دو سلول­دختری ایجاد می­گردد که هر دو در کنام باقی مانده و به صورت بنیادی باقی می­مانند] 5، 6[. بنابراین سلول­های بنیادی، سلول­های تمایز نیافته­ای می­باشند که توانایی خود تکثیری، تولید نسل تمایز یافته عملکردی و ترمیم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[.

 

سلول­های بنیادی بر اساس قابلیت تمایز به سه گروه تقسیم می­شوند:

 

همه توان: جزء اولین سلول­هایی هستند که در جنین شکل می­گیرند ( از تخمک لقاح یافته 1-3 روزه)،  قابلیت تمایز به انواع سلول­های ارگانیسم را دارند] 4[.

 

پر توان: از توده سلولی داخلی در مرحله بلاستوسیست 100تا 200 سلولی منشاء می­گیرند. این سلول­ها دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند]7[.

 

چند توان: این گروه را سلول­های بنیادی بالغ و یا سلول­های بنیادی سوماتیك نیز می‌نامند که بصورت خاموش و غیر متعهد حفظ می­شوند تا در آینده و بر اساس نیاز فعال شده و به سایر دودمان­های مربوط به همان بافت تمایز یابند]8[، به عنوان مثال سلول­های بنیادی خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلول­های خونی مانند گلبول‌های قرمز، لنفوسیت‌های B وT  و … تمایز می‌یابند [9،10[.

 

سلول­های بنیادی از لحاظ منشاٴ به دو دسته­ی، سلول­های بنیادی جنینی (ESCs) و سلول­های بنیادی بالغ تقسیم می­شوند. از آنجا که استفاده از سلول­های بنیادی جنینی با مسائل اخلاقی و قانونی بسیار مواجه است و یا پیوند این سلول­ها خطر ایجاد بافت توموری را در پی خواهد داشت ]7،11[، بنابراین کلید حل این مشکل به دست آوردن منبع عظیمی از سلو­ل­هاست به گونه­ای­که قابلیت تمایز بالایی داشته باشد و قادر باشند به دفعات نامحدودی در محیط کشت تکثیر شوند تا تعداد کافی سلول قابل دسترس برای پیوند و یا هر کاربرد درمانی و پژوهشی فراهم آورد]4[.

 

سلول­های بنیادی مزانشیمی از مهم­ترین سلول­های بنیادی بالغ است. این سلول­ها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein  و Petrokova در سال 1966 استخراج شدند ]12[. سلول­های بنیادی مزانشیمی توان تمایز به چندین دودمان سلولی ازجمله استخوان، عصب، غضروف و كبد را دارند] 13 .[این سلول­ها به عنوان یك منبع ایده­آل برای سلول درمانی، ژن درمانی و به عنوان ابزاری برای درمان بیماری­های مادرزادی محسوب می­گردند] 14[. گزارش­هایی مبنی بر استفاده از این سلول­ها در مدل­های حیوانی برای درمان جراحات نخاعی] 15،16[، سكتة مغزی ]17 [و پاركینسون] 18 [وجود دارد.

 

1-1- سلول­های بنیادی جنینی

 

اولین تحقیقات در زمینه  ESCs در دهه 1960 شروع شد، هنگامیکه Finch و   Ephrussii درسال1960 ، سلول­های سرطانی جنینی چند توان را از سلول­های زایای سرطانی تمایز نیافته انسان و موش جدا کردند] 19.[

 

این سلول­ها اولین بار در سال1981 از توده سلولی داخلی جنین موش جدا سازی شدند، سپس در سال 1998، سلول­های بنیادی جنینی انسان استخراج شدند] 20،10.[ سلول­های بنیادی جنینی فعالیت تلومرازی شدیدی دارند و قادرند به طور نامحدودی تقسیم شوند، به گونه‌ای كه سلول­های بنیادی جنینی انسانی را می‌توان در شرایط محیط كشت تا بیش از یكسال به صورت تمایز نیافته حفظ كرد و جمعیت آنرا به 80 برابر رساند] 10.[  حضور آلکالین فسفاتاز و تلومراز و بیان نشانگر اختصاصی SSEA-1 از ویژگی­های اختصاصی سلول­های بنیادی جنینی می­باشد] 21.[

 

 

1-4-2  انتقال مکانیکی…………………………………………………………………………. 19

 

1-4-3 انتقال از راه خون……………………………………………………………………….. 19

 

1-4-4 انتقال مستقیم…………………………………………………………………………… 19

 

1-5 بیماری­زایی لیشمانیا…………………………………………………………………………. 20

 

1-5-1 خصوصیات بیماری لیشمانیا………………………………………………………….. 19

 

1-5-2 لیشمانیوز احشایی……………………………………………………………………….. 20

 

1-5-3  لیشمانیوز جلدی پس از کالاآزار (PKDL)…………………………………………….. 21

 

1-5-3-1 لیشمانیوز جلدی و اشکال بالینی آن………………………………………………… 22

 

1-5-3-2  لیشمانیوز جلدی خشک…………………………………………………………….. 22

 

1-5-3-3 لیشمانیوز جلدی مرطوب…………………………………………………………….. 22

 

1-5-3-4 لیشمانیوز جلدی مزمن (Chronic Cutaneous Leisniasihmas)………………….. 23

 

1-5-3-4-1 شکل لوپوئید یا عود کننده سالک (Lupoid or Recidivan form)………………. 24

 

1-5-3-5  لیشمانیوز جلدی- مخاطی……………………………………………………………. 24

 

1-6 ایمنولوژی عفونت­های لیشمانیا……………………………………………………………… 25

 

1-6-1  مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز پوستی………………………………………… 25

 

1-6-1-1 نقش آنتی بادی یا ایمنی همورال…………………………………………………….. 25

 

1-6-1-2 نقش ایمنی سلولی در لیشمانیوز جلدی…………………………………………… 26

 

1-6-1-3 عمل سلولهای نوتروفیل و ماكروفاژ در لیشمانیوز………………………………….. 26

 

1-6-1-3  عملکرد T-CELL……………………………………………………………………….

 

1-6-2  مشخصات ایمنولوژیكی در لیشمانیوز احشایی………………………………………. 28

 

1-6-2-1 نقش ایمنی همورال در كالاآزار…………………………………………………………. 28

 

1-6-2-3 نقش ایمنی سلولی در كالاآزار………………………………………………………… 28

 

1-6-2-4 .نقش مهم سلول های CD⁺4……………………………………………………..

 

1-7  روشهای تشخیص و مطالعه لیشمانیوز…………………………………………………. 30

 

1-7-1 روشهای مستقیم تشخیص انگل………………………………………………………. 30

 

1-7-1-1 . جداسازی انگل از کناره ضایعات پوستی یا بافتهای آلوده…………………………. 31

 

1-7-1-1 رنگ آمیزی……………………………………………………………………………….. 31

 

1-7-1-2 کشت انگل……………………………………………………………………………….. 32

 

1-7-2  روشهای ایمنولوژی در شناسایی انگل…………………………………………………. 32

 

1-7-2-1 آزمایشات سرولوژی برای بررسی ایمنی همورال…………………………………… 32

 

1-7-2-2 آزمایشات ایمنولوژیکی جهت بررسی ایمنی سلولی……………………………… 33

 

1-7-2-2-1 تستهای پوستی……………………………………………………………………… 33

 

1-7-2-3 ماهیت پاسخهای ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH)…………………………………… 34

 

1-7-3 آزمون پوستی لیشمانین یا تست مونتنگرو……………………………………………….. 35

 

1-7-3-1 معرف آنتی­ژنی لیشمانین برای تست پوستی………………………………………… 35

 

1-7-4 تست سنجش تکثیر لنفوسیتی  ymphocyte proliferation test(L.T.T) …………….

 

فصل دوم : مروری بر متون گذشته

 

فصل سوم: مواد و روشها

 

3-1کشت انگل………………………………………………………………………………………. 43

 

3 -1-1  مواد مورد نیاز جهت كشت انگل………………………………………………………….. 43

 

 

3-1-2. وسایل مورد نیاز جهت كشت انگل……………………………………………………….. 43

 

3-1-3. طرز تهیه محیط كشت مایع RPMI- 1640‌…………………………………………………

 

3-1-4. طرز تهیه محیط كشت كامل………………………………………………………………….. 44

 

3-1-5. طرز تهیه محیط كشت NNN……………………………………………………………….

 

3-1-6. طرز تهیه (PBS) Phosphate Buffered Saline…………………………………………..

 

3-1-7. روش كشت انگل……………………………………………………………………………. 45

 

3-1-8. روش شمارش سلولها………………………………………………………………………. 46

 

3-1-8-1. مواد و وسایل لازم جهت شمارش انگل………………………………………………… 46

 

3-1-8-2. شمارش با لام نئوبار……………………………………………………………………… 46

 

3-2. جداسازی انگلها با limiting dilution assay……………………………………………….

 

3-2-1. مواد و وسایل مورد نیاز برای Limiting dilution assay……………………………….

 

3-2-2. مراحل Limiting dilution assay…………………………………………………………

 

3-3. تهیه کرایو برای ذخیره در بانک سلولی…………………………………………………….. 50

 

3-3-1. مواد و وسایل لازم جهت تهیه کرایو……………………………………………………… 50

 

3-4 تهیه آنتی­ژن Freeze – thaw از انگلها جهت درهم ریختگی غشاء و بروز تمامی آنتی­ژن­ها…. 52

 

3-5 الکتروفورز آنتی­ژن­های پروتئینی در ژل پلی­آکریل­آمید ( SDS-PAGE )……………………….. 53

 

3-5-1 اصول الکتروفورز در ژل پلی­آکریل­آمید……………………………………………………….. 53

 

3-5-2 سیستم بافری………………………………………………………………………………. 54

 

3-5-3  مواد و وسایل مورد نیاز برای SDS-PAGE………………………………………………..

 

3-5-4 آماده­سازی نمونه………………………………………………………………………….. 57

 

3-5-6 طرز تهیه بافر الکترود…………………………………………………………………………. 57

 

3-5-7. روش انجام SDS-PAGE…………………………………………………………………….

 

3-5-8 روش رنگ­آمیزی با کوماسی آبی R- 250…………………………………………………

 

مواد مورد نیاز رنگ­آمیزی کوماسی آبی R- 250:………………………………………………..

 

3-6 سنجش میزان پروتئین تام با Bradford assay…………………………………………..

 

3-6-1 مواد و معرف­های مورد نیاز تست Bradford……………………………………………..

 

3-6- 2 روش کار سنجش پروتئین تام……………………………………………………………. 61

 

3-7 تست Lymphocyte transformation test (L.T.T)………………………………………..

 

3-7-1 روش انجام تست L.T.T………………………………………………………………….

 

1-3-7-1. مواد و وسایل لازم جهت انجام تست L.T.T………………………………………..

 

3-8 ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………………………………………. 66

 

3-8-1 مواد و وسایل مورد نیاز ایمنی­زایی در خوکچه هندی…………………………………….. 67

 

3-8-2  نحوه ایمنی­زایی در خوکچه………………………………………………………………… 67

 

3-9 تزریق داخل پوستی آنتی­ژن­ها و سنجش میزانDTH…………………………………..

 

3-9-1 مواد و وسایل لازم برای تزریق داخل پوستی و سنجش میزان DTH…………….

 

3-9-2  مراحل تزریق داخل پوستی………………………………………………………………. 69

 

3-9-3  نحوه سنجش میزان DTH………………………………………………………….

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1 کشت اولیه و جداسازی تک کلون­ها با روش limiting dilution………………………

 

4-2  بررسی پروفایل پروتئینی در آنالیز تک کلون­ها…………………………………………… 72

 

4-3 نتایج میزان پروتئین تام آنتی­ژن­ها به روش Bradford………………………………..

 

4-4 بررسی نتایج تست L.T.T………………………………………………………………

 

4-4-1  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن B…………………………………………….

 

4-4-2  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن C…………………………………………….

 

4-4-3.  نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن D…………………………………………….

 

4-4-4 نتایج تست L.T.T در نمونه آنتی­ژن لیشمانین استاندارد (M)……………………… 76

 

4-4-5.  بررسی نتایج حاصل  از اندکس تحریکی تمامی آنتی­ژن­ها و میانگین آنها در مقایسه با Con-A

 

4-4-6 بررسی نتایج کلی L.T.T…………………………………………………………….

 

4-5 بررسی نتایج تست­های DTH بر روی خوکچه­های هندی………………………………. 79

 

4-5-1  نتایج تست DTH 24 ساعته………………………………………………………… 79

 

4-5-2 نتایج تست DTH 48 ساعته……………………………………………………………. 82

 

4-5-3 نتایج تست DTH 72 ساعته………………………………………………………… 83

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

 

منابع……………………………………………………………………………………………… 95

 

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………….. 106

 

خلاصه فارسی:

 

مقدمه: لیشمانیا ماژور یک انگل پاتوژن پروتوزوأ داخل سلولی است که عامل طیف وسیعی از عفونت­های پوستی با پیامدهای بالینی متنوع، از یک زخم پوستی خود بهبود شونده تا زخم­های گسترش یافته غیر بهبود شونده می­باشد. ایمنی سلولی نقش مهمی در مقاومت در برابر لیشمانیا ماژور بازی می­کند. واکنش­های حساسیت شدید دیررس که با تست­های پوستی لیشمانین تشخیص داده می­شوند یک روش تشخیصی برای سنجش ایمنی سلولی است و بطور وسیع برای سنجش اپیدمیولوژیکی افراد در معرض آنتی­ژن­های لیشمانیایی، سنجش واکسن­های کاندید و در کمک به تشخیص، مورد استفاده است. تست پوستی لیشمانین پبطور عمومی به نام تست مونتنگرو یا تست لیشمانین شناخته می­شود، که نیازمند یک آنتی­ژن استاندارد خالص و هموژن می­باشد.

 

هدف: تهیه و سنجش تک­کلون­های جداشده از لیشمانیا ماژور برای تست­ پوستی

 

روش: جداسازی تک­کلون­ها از سوش لیشمانیا ماژور مرجع (MRHO/IR/75/ER) به روش رقت دهی محدود شونده انجام گرفت. کلون­های جداشده با استفاده از روش­های برون­تنی، SDS-PAGE و تست تکثیر لنفوسیتی با استفاده از سلول­های تک­هسته­ای خون محیطی افراد  بهبود یافته از عفونت لیشمانیا ماژور مورد ارزیابی قرار گرفتند. توانایی هر تک­کلون جداشده با تست پوستی چهار خوکچه هندی ایمن شده دربرابر لیشمانیا ماژور مورد سنجش قرار گرفته شدند. تک­ کلون­ های جداشده به­همراه لیشمانین در ناحیه اصلاح شده شکمی حیوان­ها بطور داخل پوستی تزریق شدند.

 

نتایج: نتایج نشان دادند که سه نمونه از هفت تک­کلون­ ( نمونه D و(B,C در آنالیزهای SDS-PAGE یک تک باند را نشان دادند. این تک­کلون­ها برای سنجش در تست تکثیر لنفوسیتی مورد استفاده قرار گرفتند که همگی میزان ضریب تحریک (03/2±71/8، 65/2±71/8، 13/2±43/8 به ترتیب) قابل مقایسه­ای با لیشمانین ( 512/3±10) نشان دادند. سنجش درون­تنی تک­کلون­های جداشده، در خوکچه­های هندی نشان داد که هر سه تک­کلون میزان القاء قابل قبولی در مقایسه با لیشمانین از خود نشان دادند. بعلاوه، کلون C (83/0±333/7) میزان القاء معنادار بیشتری از لیشمانین ( mm00/4) در خوکچه­های هندی تست شده با آنتی­ژن C نشان داد.

 

یافته ­ها: اطلاعات نشان دادند که تک­ کلون­های جداشده توانایی القاء واکنش­های درون­تنی و برون­تنی قابل مقایسه­ای با لیشمانین استاندارد دارند و امکان استفاده جهت آنتی­ژن خالص و هموژن را در تست­های پوستی در مطالعات لیشمانیوزی را دارند

 

مقدمه:

 

انگل لیشمانیا یک پروتوزوای جنس لیشمانیا یک پاتوژن داخل سلولی است که می تواند باعث ایجاد طیف وسیعی از بیماری های انسانی از یک زخم پوستی ساده تا عفونت های احشایی شود که با گزش پشه خاکی آلوده به میزبان پستاندار از جمله انسان منتقل می­شود(99).

 

به بیماری­های حاصل از انگل های جنس لیشمانیا، لیشمانیازیس گفته می­شود. این بیماری در 88 کشور در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری جهان گسترش یافته است و اینک 12 میلیون نفر به این انگل مبتلا می باشند و350 میلیون نفر در خطر ابتلا به این بیماری قرار دارند. با وجود کوشش هایی که برای مبارزه با بیماری انجام شده، سالیانه 1 تا 2 میلیون مورد جدید جهانی گزارش می شود ، که 5/1 میلیون مورد از نوع جلدی و500هزار نفر از انواع احشایی می­باشد. در انسان بیماری به سه فرم بالینی جلدی (CL)[1]، جلدی مخاطی (ML)[2] و احشایی (VL)[3] بروز می­کند(57،83).

 

عفونتهای پارازیتی مثل لیشمانیوز می توانند در  بیماریهای ایمنوساپرس کننده مثلHIV پدیدار شود. عفونت توأم این بیماری­ها با لیشمانیوز بعنوان یک تهدید جدی در کشورهایی است که هر دو عامل پاتوژنیک را دارند( 106).

 

سازمان بهداشت جهانی آن را  در زمره 8 بیماری مهم انگلی دنیا با شیوع بالا در جهان قرار داده است. کنترل این بیماری از اولویتهای سیستم بهداشتی و درمانی جهان است و نیز از اولویتهای تحقیقاتی انیستیتو پاستور ایران نیز می­باشد(49).

 

افراد در تمام سنین در معرض ابتلا به این بیماری می باشند. بیش از %90 موارد ابتلا به لیشمانیای پوستی در کشورهای افغانستان، عراق، پرو، عربستان سعودی و متأسفانه ایران گزارش شده است( 47). این انگل امروزه بصورت انگلی فرصت طلب در افراد دچار نقص ایمنی درآمده است و به دلیل اینکه در ایران نیز موارد ابتلا به آن زیاد می باشد، لذا لازم است در زمینه شناخت بیشتر خود انگل و راه­های مقابله با آن مطالعات وسیعتری صورت گیرد.

 

فصل اول: کلیات

 

تعریف بیماری لیشمانیوز:

 

انگل پروتوزوای جنس لیشمانیا  یک پاتوژن داخل سلولی است که می تواند باعث بروز طیف وسیعی از بیماری های انسانی از یک زخم پوستی تا عفونت های احشایی شود. این انگل­ها با گزش پشه خاکی آلوده به میزبان پستاندار از جمله انسان منتقل می­شود( 47). این بیماری در نواحی روستایی و شهری بیشتر نقاط کشور وجود دارد. ناقل بیماری تنها یک سوم اندازه پشه معمولی است و به سختی با چشم دیده می شود. انسان در نوع شهری لیشمانیوز (سالک شهری) به عنوان میزبان اصلی محسوب می شود و به ندرت اتفاق می افتد که از مادر باردار به جنین یا با انتقال خون یا سوزن آلوده سرایت کند( 47).

 

این بیماری در انسان می تواند به اشکال مختلف بروز نماید و در مورد فرم احشایی در صورت عدم درمان حتی به مرگ منجر گردد(29،17). ژنوم این انگل در سال 2002 حدود 32 مگا باز ژنوم و8500 ژن تخمین زده شد که با ترجمه آنها بیشتر از 10000 پروتئین حاصل خواهد شد(16).

 

یکی از خصوصیات مهم انگل لیشمانیا، رشد و تکثیرآن در درون فاگولیزوزوم­های ماکروفاژها است. تعداد کمی از میکروارگانسیم ها قادرند که تحت چنین شرایطی ودر مجاورت انواع آنزیم های هیدرولیتیک زندگی کنند. بنابراین مراحلی که منجر به ورود انگل به درون فاگولیزوزوم می­گردد از اهمیت خاصی برخوردار است(77).

 

میزبان مهره دار برای انگل شامل میزبان پستاندار وخزنده است که میزبان پستاندار شامل انسان، سگ، سگ سانان و برخی جوندگان ودیگر جانوران وحشی می باشد. لیشمانیوزها عموما توسط گونه های پشه خاکی منتقل می شوند. ناقل این انگل ها در دنیای قدیم (همه قاره ها بجز آمریکا) پشه خاکی های متعلق به جنس فلوبوتوموس می باشد و در دنیای جدید گونه های مختلف پشه خاکی های ماده از جنس لوتزومیا
می­باشد(20،92،69،101).

 

عامل بیماری­زایی در لیشمانیوز، یعنی لیشمانیا، از راسته کینتوپلاست داران است که برحسب سیر تکاملی و محیط زیست خود به دو شکل بی تاژک یا آماستیگوت (یا جسم لیشمن) در درون سلولهای سیستم رتیکولواندوتلیال مهره داران مانند ماکروفاژها و شکل تاژکدار پروماستیگوت (یا لیپومونادی) در درون بدن پشه خاکی ناقل و محیط کشتهای مصنوعی مثل NNN[1] دیده می­شود (3).

 

2-1-1- تاریخچه لیشمانیوز در جهان

 

کانینگهام[1] در سال 1885 در فرانسه ترشحات زخم پوستی بیماری را که به آن تاول دهلی می گفتند، مورد مطالعه قرار دارد. این محقق، ماکروفاژهای میزبان را انگل آمیبی پنداشته و اجسام داخل ماکروفاژها را هاگ (اسپور) تصور کرده بود(64). رایت اجسامی شبیه به آنچه کانینگهام گزارش داده بود در زخم پوستی دختری که از ارمنستان به بوستون مهاجرت کرده بود مشاهده کرد. او این انگل را هلیکوزوماتروپیکوم نامید و فکر می کرد که متعلق به گروه میکروسپوریدیا باشد(3و18). در سال 1900 لیشمان[2] در طحال سربازی که از تب دام دام[3] در هندوستان مرده بود اجسام بیضی شکلی را در داخل سلول های بزرگی مشاهده کرد (دام دام شهری است که بیماری لیشمانیوزاحشائی در آن دیده شده بود). لیشمان نتیجه مطالعات خود را در سال1903 منتشر ساخت.