1-4-9. اندوتوکسین………………………………………………………………………………………………………………………………… 19

 

1-5. سویه های بوردتلا پرتوسیس ………………………………………………………………………………………………………… 19

 

1-6. اپیدمیولوژی ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 20

 

1-6-1. وضعیت بیماری در ایران……………………………………………………………………………………………………………. 21

 

1-7. بیماری زایی سیاه سرفه  ………………………………………………………………………………………………………………. 21

 

1-8. علائم کلینیکی ………………………………………………………………………………………………………………………………. 22

 

1-9. تشخیص بیماری …………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

 

1-9-1. تشخیص بالینی………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

 

1-9-2. علائم کلینیکی در نوزادان…………………………………………………………………………………………………………. 24

 

1-9-3. کودکان، نوجوانان و بزرگسالان………………………………………………………………………………………………….. 25

 

1-10. پاسخ ایمنی در برابر سیاه سرفه ………………………………………………………………………………………………… 26

 

1-10-1. پاسخ ایمنی همورال………………………………………………………………………………………………………………… 27

 

1-10-2. پاسخ ایمنی سلولی…………………………………………………………………………………………………………………. 28

 

1-11. روش های آزمایشگاهی تشخیص………………………………………………………………………………………………… 30

 

1-11-1. کشت………………………………………………………………………………………………………………………………………… 30

 

1-11-2. سرولوژی………………………………………………………………………………………………………………………………….. 30

 

1-11-3. PCR …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 32

 

1-12. مدیریت بیماری…………………………………………………………………………………………………………………………….. 33

 

1-13. پیشگیری …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 34

 

1-13-1. راهبردهای بالقوه در مهار بیماری سیاه سرفه در اوایل نوزادی……………………………………………. 35

 

1-13-1-1. واکسیناسیون بالغین و سالمندان……………………………………………………………………………………… 37

 

1-13-1-2. حفاظت غیرمستقیم نوزادان از طریق واکسیناسیون والدین………………………………………….. 37

 

1-13-1-3. ایمن سازی نوزادان و کودکان…………………………………………………………………………………………… 38

 

1-13-1-4. واکسیناسیون مادر در دوران بارداری……………………………………………………………………………….. 38

 

1-14. استراتژی های واکسن………………………………………………………………………………………………………………….. 39

 

1-14-1. واکسن غیر سلولی سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………. 39

 

1-14-2. واکسن سلولی سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………………. 40

 

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

 

2-1. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه…………………………………………………………………………………………………. 42

 

2-1-1. تعریف تست كنترل سمیت زدایی (MWGT) ……………………………………………………………………. 43

 

2-1-2. تعریف تست حفاظتی داخل مغزی موش (تست توانمندی Potency test) …………………… 44

 

2-1-3. ابداع روش کشت……………………………………………………………………………………………………………………….. 44

 

2-1-4. جداسازی سلول باکتری از کشت……………………………………………………………………………………………… 45

 

2-2. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه در انستیتو رازی…………………………………………………………………….. 46

 

2-3. غیرفعال سازی سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه…………………………………………………………….. 47

 

2-3-1. استفاده از فرمالین و تیومرسال برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه…………. 47

 

2-3-2. استفاده از گلوتار آلدهید برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه……………………. 49

 

2-3-3. استفاده از حرارت برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه……………………………….. 49

 

فصل سوم: مواد و روش ها

 

3-1. تجهیزات و وسایل ………………………………………………………………………………………………………………………….. 51

 

3-2. مواد و محیط ها ……………………………………………………………………………………………………………………………… 52

 

3-2-1. محیط کشت آگار بورده ژانگو……………………………………………………………………………………………………. 52

 

3-2-2. محیط کشت وِروِی…………………………………………………………………………………………………………………….. 53

 

3-2-3. محیط B₂…………………………………………………………………………………………………………………………………… 54

 

3-2-4. محیط کشت سویابین کازئین…………………………………………………………………………………………………… 54

 

3-2-5. محیط تیوگلیکولات براث………………………………………………………………………………………………………….. 55

 

3-3. روش کار …………………………………………………………………………………………………………………………………………. 56

 

3-3-1. انتخاب سویه های بوردتلا پرتوسیس……………………………………………………………………………………….. 56

 

3-3-1-1. لیوفیلیزه کردن……………………………………………………………………………………………………………………… 56

 

3-3-2. کشت باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………………….. 56

 

3-3-2-1. کشت تجدید حیات روی محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………. 56

 

3-3-2-2. کشت بذر روی محیط وِروِی………………………………………………………………………………………………… 57

 

3-3-2-3. مراحل انجام کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه…………………………………………………………….. 57

 

3-3-2-3-1. استریلیزاسیون فرمانتور…………………………………………………………………………………………………… 57

 

3-3-2-3-2. آماده سازی و بهینه سازی محیط کشت فرمانتوری……………………………………………………… 58

 

3-3-2-3-3. تلقیح بذر به محیط کشت در فرمانتور…………………………………………………………………………… 58

 

3-3-3. جداسازی باکتری سیاه سرفه از محیط کشت…………………………………………………………………………. 59

 

3-3-3-1. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سانتریفوژ…………………………………………………………………. 59

 

3-3-3-2. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سیستم میکرو فیلتراسیون……………………………………. 59

 

3-3-4. غیرفعال سازی سلول باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………………… 60

 

3-3-5. سمیت زدایی سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………. 60

 

3-3-5-1. سمیت زدایی با استفاده از فرمالین……………………………………………………………………………………… 61

 

3-3-5-2. سمیت زدایی با استفاده از تیومرسال………………………………………………………………………………….. 61

 

3-3-6. تست های کنترلی سوسپانسیون سیاه سرفه…………………………………………………………………………… 61

 

3-3-6-1. تست استریلیتی……………………………………………………………………………………………………………………. 61

 

3-3-6-2. تست کنترل غیرفعال بودن باكتری…………………………………………………………………………………….. 62

 

3-3-6-3. تست کنترل سمیت زدایی (MWGT) …………………………………………………………………………… 62

 

3-3-6-4. تست توانمندی……………………………………………………………………………………………………………………… 62

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1. تجدید حیات بذر بر روی محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………………… 64

 

4-2. تهیه بذر در محیط وِروِی……………………………………………………………………………………………………………….. 64

 

4-3. کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن……………………………………………………………… 64

 

4-4. جداسازی باکتری سیاه سرفه از کشت………………………………………………………………………………………….. 67

 

4-5. غیرفعال سازی و سمیت زدایی باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن……………………………………… 69

 

4-5-1. سمیت زدایی با فرمالین…………………………………………………………………………………………………………….. 69

 

4-5-2. سمیت زدایی با تیومرسال…………………………………………………………………………………………………………. 69

 

4-6. آزمایش های کنترلی سوسپانسیون های سیاه سرفه……………………………………………………………………. 69

 

4-7. نتایج حاصل از آزمون MWG در کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه

 

سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال…………………………………………………………………………………………….. 72

 

4-8. آزمون MWG و مقایسه تغییرات اوزان موش ها……………………………………………………………………….. 75

 

4-9. تست توانمندی واکسن های آزمایشی سیاه سرفه……………………………………………………………………….. 80

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

 

بحث ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 83

 

نتیجه گیری و پیشنهادات ………………………………………………………………………………………………………………………. 88

 

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 89

 

خلاصه انگلیسی ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 97

 

ضمایم ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 98

 

 فهرست جداول

 

عنوان                                                                                                                             صفحه

 

جدول1-1. آنتی ژن های مختلف سیاه سرفه…………………………………………………………………………………………… 9

 

جدول1-2. علائم کلینیکی بیماری سیاه سرفه……………………………………………………………………………………… 26

 

جدول1-3. آنتی بیوتیک های مورد استفاده در درمان سیاه سرفه حاد و رژیم مصرف آن……………….. 34

 

جدول1-4. واکسیناسیون سیاه سرفه در کشورهای مختلف…………………………………………………………………. 36

 

جدول2-1. ترکیب محیط لیستر و B₂  بر اساس گرم در لیتر…………………………………………………………….. 45

 

جدول3-1. لیست دستگاه ها و تجهیزات مورد استفاده………………………………………………………………………… 51

 

جدول3-2. لیست مواد و محیط های مورد استفاده در تولید واکسن سیاه سرفه………………………………. 52

 

جدول3-3. ترکیبات محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………………………………….. 53

 

جدول3-4. ترکیبات محیط کشت وِروِی………………………………………………………………………………………………… 53

 

جدول3-5. ترکیبات محیط کشت B₂…………………………………………………………………………………………………… 54

 

جدول3-6. ترکیبات محیط کشت سویابین کازئین………………………………………………………………………………. 55

 

جدول4-1. اطلاعات دوره كشت باكتری سیاه سرفه برای تولید واكسن…………………………………………….. 68

 

جدول4-2. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باكتری  سیاه سرفه سمیت  زدایی شده با فرمالین……………………………………………………………………………………………………………………………….. 70

 

جدول4-3. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باكتری  سیاه سرفه سمیت  زدایی شده با تیومرسال…………………………………………………………………………………………………………………………….. 71

 

جدول4-4. نتایج حاصل از کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال با استفاده از آزمون MWG………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 73

 

جدول4-5. نتایج كنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین با استفاده از آزمون MWG   76

 

جدول4-6. نتایج كنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با تیومرسال با استفاده از آزمون MWG 77

 

جدول4-7. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV)     80

 

جدول4-8. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال (TDV)  81

 

 فهرست نمودارها

 

عنوان                                                                                                                صفحه

 

 

 

نمودار1-1. مقایسه تعداد افراد زیر یک سال ایمن شده با واکسن DTP در سه کشور مختلف در سال

 

2000 تا 2010 ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 6

 

نمودار4-1. تغییرات pH کشت سویه 134 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور….. 65

 

نمودار4-2. تغییرات pH کشت سویه 509 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور….. 65

 

نمودار4-3. مقایسه­ی میانگین جذب نوری در طول موج های530 و590 در مقدار جرم  باكتری در هنگام برداشت در بچ های مختلف سویه 134 و 509……………………………………………………………………………………………………………… 66

 

نمودار4-4. مقدار غلظت نهایی باكتری سیاه سرفه (cell10⁹×1) سویه 134 در پایان دوره كشت در هنگام برداشت   66

 

نمودار4-5. مقدار غلظت نهایی باكتری سیاه سرفه (cell10⁹×1) سویه 509 در پایان دوره كشت در هنگام برداشت   67

 

نمودار4-6. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه  سویه 134  توسط  فرمالین و تیومرسال با استفاده از تست MWG ……………………………………………………………………………………………………………………….. 74

 

نمودار4-7. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی  سیاه سرفه در سویه 509 توسط فرمالین و تیومرسال با استفاده از تست  MWG……………………………………………………………………………………………………………………….. 74

 

نمودار4-8. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واكسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین نسبت به تیومرسال در سویه 134……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 78

 

نمودار4-9. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واكسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین

 

نسبت به تیومرسال در سویه  509………………………………………………………………………………………………………. 78

 

نمودار4-10. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با سوسپانسیون های سمیت زدایی شده سویه 134 با تیومرسال و فرمالین نسبت به موش های گروه كنترل……………………………………………………………………………………………….. 79

 

 

2-1-4- توانمندسازی.. 17

 

2-1-5- مشاركت… 19

 

2-1-6- توانمندسازی و بهسازی مشاركتی.. 22

 

2-1-7- فقر و محرومیت اقتصاد. 22

 

2-1-8- كارآفرینی روستایی.. 23

 

2-1-9- توسعه. 23

 

 

 

2-2-1- تاریخچه و مبانی نظری مطالعات فقر. 26

 

2-2-2- دیدگاه های مرتبط با کارآفرینی.. 30

 

2-2-3- دیدگاه جامعه شناختی و جمعیت شناختی.. 30

 

2-2-4- دیدگاه روانشناختی.. 31

 

2-2-5- دیدگاه اقتصادی (کارآفرینی درون تئوری اقتصادی) 31

 

2-2-6- دیدگاه توسعه ای و محیطی.. 33

 

2-2-7- دیدگاه نهادی.. 33

 

 

 

2-3-1- دیدگاه روانشناختی.. 34

 

2-3-2- دیدگاه جامعه شناختی.. 34

 

2-3-3- دیدگاه علوم سیاسی.. 35

 

 

 

2-4-1- رویکردهای نظری توانمندسازی.. 36

 

2-4-2- فرآیند توانمندسازی.. 37

 

2-4-3- چارچوب توانمندسازی.. 38

 

2-4-4- حوزه های توانمندسازی مددجویان.. 40

 

2-4-5- ساماندهی افراد و ایجاد تشکل.. 42

 

2-4-6- رویكردهای سازمانی.. 43

 

2-4-7- نظریه های گونه ی اول. 44

 

2-4-8- نظریه های گونه ی دوم. 45

 

2-4-9- نظریه های گونه ی سوم. 45

 

2-4-10- نظریه های گونه ی چهارم. 45

 

2-4-11- نوع شناسی کمیته امداد امام خمینی (ره) 46

 

2-4-12- اهمیت موضوع توانمندسازی در کمیته امداد امام خمینی (ره) 48

 

2-4-13- جایگاه کمیته امداد در توانمندسازی مددجویان تحت پوشش این نهاد. 49

 

2-4-14- توانمندسازی مددجویان.. 50

 

2-4-15- عوامل موثر بر توانمندسازی خانواده های تحت حمایت کمیته امداد. 51

 

 

 

فصل سوم: مواد و روش ها

 

 

 

 

 

3-1-1- موقعیت، حدود و وسعت منطقه مورد مطالعه. 56

 

3-1-2- توپوگرافی و ژئومورفولوژی.. 58

 

3-1-3- اقلیم. 59

 

3-1-4- منابع آب.. 64

 

 

 

3-2-1- جمعیّت و ویژگیهای آن.. 70

 

 

 

 

 

3-4-1- روش پژوهش…. 76

 

3-4-2- جامعه آماری و تعداد نمونه. 77

 

3-4-3- شاخصهای تحقیق.. 80

 

3-4-4- روش و ابزار گردآوری دادهها و اطلاعات.. 83

 

3-4-5- شیوه تجزیه و تحلیل داده‎ها 83

 

3-4-6- مدل تصمیم‎گیری چند شاخصه (MCDM) 84

 

3-4-7- فرآیند تحلیل سلسله مراتبی (AHP) 86

 

3-4-8- روایی و پایایی ابزار تحقیق.. 90

 

 

 

فصل چهارم: یافته­های تحقیق

 

 

 

 

 

4-1-1- وضعیت سنی پاسخگویان.. 94

 

4-1-2- وضعیت جنسی.. 96

 

4-3-1- وضعیت سواد. 96

 

 

 

4-2-1- علل قرار گرفتن تحت پوشش کمیته امداد. 98

 

4-2-2- روند تغییرات خانوارهای تحت پوشش کمیته امداد. 99

 

4-3-3- شدت اثرات موانع یا محدودیتهای مطرح در توانمندسازی خانوارهای روستایی………………………..103

 

 

 

فصل پنجم: جمع­بندی و نتیجه گیری

 

 

 

 

 

 

 

 

2-7-3- پروتئین های L1 و L2.. 28

 

2-8- تیپ بندی پاپیلوماویروس ها 29

 

2-9- بیماری زایی.. 29

 

2-9-1- عفونت پوستی.. 30

 

2-9-2- عفونت حفره دهانی.. 31

 

2-9-3- عفونت مجاری تنفسی.. 31

 

2-9-4- سرطان مقعد. 31

 

2-9-5- سرطان گردن رحم. 32

 

2-9-6- HPV در کودکان. 34

 

2-10- اپیدمیولوژی.. 35

 

2-11- مطالعه سرطان گردن رحم و عفونت پاپیلوماویروس در ایران. 37

 

2-12- تشخیص…. 38

 

2-13- پاسخ ایمنی در برابر HPV.. 40

 

2-13-1- ایمنی اختصاصی.. 41

 

2-13-1- 1- پاسخ ایمنی هومورال. 41

 

2-13-1-2- پاسخ ایمنی سلولی.. 42

 

2-13-2-پاسخ ایمنی ذاتی.. 43

 

2-14-  درمان. 44

 

2-15- پیشگیری.. 45

 

2-16- واکسیناسیون. 46

 

2-17- واکسیناسیون علیه HPV.. 47

 

2-17-1- واکسن های نوترکیب با ناقل زنده 50

 

2-17-2-واکسن های پروتئینی و پپتیدی.. 51

 

2-17-3-ذرات شبه ویروس( VLPs). 52

 

2-17-4-  DNA واکسن ها 56

 

-5-17-2 واکسن های خوراکی.. 59

 

2-18- اهمیت پاسخ های ایمنی هومورال و واکسن های پیشگیری کننده 63

 

2-19- اهمیت پاسخ های ایمنی سلولی و واکسن های درمان کننده 64

 

2-20-ایمونوانفورماتیک در علم واکسن.. 65

 

2-20-1-ﭘﺎﯾﮕﺎه های داده ها (Databases) 68

 

2-20-1-1- پایگاه های داده اﯾﻤﻮﻧﻮﻣﯿﮏ… 68

 

2-20-1-2- ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اپی توپ ها و ﺳﺎﺧﺘﺎرهای آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﺑﺮای ﺳﻠﻮل B.. 69

 

2-20-1-3- ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮلT.. 72

 

2-20-2-اﺑﺰارها و اﻟﮕﻮرﯾﺘﻢ های ﻣﺘﻨﻮع ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ.. 73

 

2-20-2-1-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B.. 74

 

2-20-2-2-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ﺑﺮ ﻣﺒﻨﺎی ﻣﯿﻞ ذاﺗﯽ آﻣﯿﻨﻮاﺳﯿﺪ. 75

 

2-20-2-3-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ ﺳﻠﻮلB ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از روش های ﯾﺎدﮔﯿﺮی ﻣﺎﺷﯿﻦ.. 77

 

2-20-2-4-روش ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﻏﯿﺮ پیوسته ﺳﻠﻮل B.. 78

 

2-20-2-5-ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ های ﺳﻠﻮل T.. 82

 

2-20-3- ﮐﺎرﺑﺮدهای ﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اﭘﯽ ﺗﻮپ.. 83

 

2-21-واکسن همگانی (Universal vaccine) 84

 

2-22- واكسن سازی معكوس Reverse Vaccinology.. 84

 

2-23-ادجوانت ها 86

 

2-24-به دست آوردن قطعه DNA یاژن مورد نظر. 89

 

2-25-کلونینگ ژن. 90

 

2-25-1- مراحل کلون کردن ژن. 90

 

2-25-2- میزبان کلونینگ… 90

 

2-26- آنزیم های محدود کننده 91

 

2-26-1-آنزیم لیگاز. 91

 

2-27- حامل های کلونینگ… 91

 

2-28-غربالگری وجود ژن. 92

 

2-29-انواع سیستم های بیانی و مزیت اشرشیاکلی.. 92

 

2-30-وکتورهای بیان کننده 94

 

2-30-1- وکتورهای بیان کننده سیستمpET.. 94

 

2-31-وکتورهای پلاسمیدی.. 96

 

2-32-توالی شاین دلگارنو(SD)(Shine-delgarno) 97

 

2-33-استراتژی بیان در سیستمpET.. 97

 

2-34-نقشه و مشخصات وکتورpET28a(+) 98

 

2-35-تولید پروتئین نوترکیب.. 99

 

2-36-مراحل تهیه یک پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی.. 99

 

2-37-بیان ژن و تولید پروتئین نوترکیب در E.coli. 100

 

2-38-راهکارهای افزایش تولید پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی.. 101

 

2-39-تخلیص پروتئین نوترکیب.. 102

 

2-40- فرضیات و هدف از انجام تحقیق.. 103

 

2-40-1 -فرضیات.. 103

 

2-40-2 – هدف از انجام تحقیق.. 103

 

 

 

فصل سوم: مواد و روش ها…104

 

3-1-مجموعه توالی های پروتئین.. 105

 

3-2-پیش بینی اپی توپ سلول B.. 105

 

3-3-قابلیت دسترسی اپی توپ به حلال. 106

 

3-4-محل های N-Glycosylated.. 107

 

3-5-ترجمۀ معکوس اولین ساختمان. 107

 

3-6-بهینه سازی کدون، تعیین کدون های نادر (rare codon) 108

 

3-7-تولید ساختار واکسن.. 109

 

3-8-تهیه باکتری مستعد شده 109

 

3-9-ترانسفورم نمودن پلاسمید بیانی.. 111

 

3-10- SDS-PAGE. 114

 

3-11-بیان پروتئین نوترکیب HPV   واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس کم. 115

 

3-12-کشت انبوه سویه بیانی و تهیه جسم سلولی.. 117

 

3-13-بیان پروتئین نوترکیب HPV  واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس بالا. 117

 

3-14-الکتروفورز پروتئین در ژل آکریل آمید در حضور SDS. 119

 

3-15- رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلوR-350.. 122

 

3-15-1- روش تهیه محلول ها 122

 

3-15-2- روش رنگ آمیزی.. 123

 

3-16- وسترن بلاتینگ… 123

 

3-16-1- انتقال در تانک… 124

 

3-16-2- مسدودسازی غشا 125

 

3-16-3- تشخیص با آنتی بادی.. 125

 

3-17-تخلیص پروتئین با یون های نیکل متصل به ماتریکس NTA نوترکیب HPV   واکسن کاندید چند اپی توپی روی ماتریکس Ni-NTA.. 126

 

3-18-بهینه سازی تخلیص…. 127

 

3-19-ارزیابی پروتئین تخلیص شده با روش SDS-PAGE. 127

 

3-20-تخلیص انبوه پروتئین نوترکیبHPV  واکسن کاندید چند اپی توپی.. 128

 

3-21- دیالیز و تغلیظ پروتئین HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده 134

 

3-22- ارزیابی پروتئین تخلیص شده 136

 

3-23- روش برادفورد. 136

 

3-23-1- طرز تهیه محلول های مورد نیاز. 137

 

3-23-2- طرز تهیه محلول برادفورد. 137

 

3-23-3- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین ذخیره با غلظت 1000μic/ml. 137

 

3-23-4- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین با غلظت 10,100mic/ml 137

 

3-24- بررسی خلوص پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با روش SDS-PAGE. 138

 

3-25-بررسی پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با وسترن بلات.. 138

 

3-26-پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی.. 139

 

3-27- حیوان آزمایشگاهی.. 139

 

3-28-ادجوانت‌ فروند ناقص…. 139

 

3-29-گروه‌های تجربی و واکسیناسیون موش‌ها 140

 

3-30- بررسی پاسخ های همورال. 141

 

3-30-1- بررسی سطح آنتی بادی توتال در رقت های مختلف سرمی.. 142

 

 

 

فصل چهارم: نتایج ….144

 

4-1-پیش بینی اپی توپ سلول B.. 145

 

4-2- قابلیت دسترسی اپی توپ ها 149

 

4-3-محل های N-Glycosylated.. 151

 

4-4-انتخاب اپی توپ ها و اتصال پپتیدها برای تولید ساختمان واکسن.. 153

 

4-5-ارزشیابی توالی پروتئین.. 155

 

4-6-ترجمۀ معکوس ساختمان اول. 157

 

4-7-نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش      SDS-PAGE.. 159

 

4-8- نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش وسترن بلاتینگ… 161

 

4-9-نتایج بررسی پاسخ های ایمنی همورال. 162

 

4-9-1- نتایج بررسی سطح آنتی‌بادی توتال اختصاصی واکسن کاندید. 162

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری………164

 

5-1- بحث و نتیجه گیری.. 165

 

5-2-پیشنهادات و چشم اندازها 168

 

 References      …169

 

ضمائم:

 

فهرست اشکال :

 

شکل 2-1.ساختمان ویروس پاپیلوما……………………………………………………………………………………………………………………….16

 

شکل 2-2. نقشه ژنومی در پاپیلوما ویروس……………………………………………………………………………………………………………..18

 

شکل2-3.نمایی از تکثیر پاپیلوما ویروس در ارتباط با عملکرد پروتئین های غیرساختاری……………………………………………..18

 

شکل2-4. مواردی از عفونت پاپیلوما ویروس ها……………………………………………………………………………………………………..30

 

شکل 2-5. مراحل اصلی پاپیلوماویروس و محل آنها در اپی تلیوم اسکوآموس…………………………………………………………….41

 

شکل 2-6. ساختار شماتیک و توالی ژنی ناحیه بیانی pET-28a(+)…………………………………………………………………………..99

 

شکل4-1. نمایش انتخاب اپی توپ ها با میزان بالای قابلیت دسترسی به حلال ، در اینجا ساختمان های پروتئین L1 از سروتایپ های HPV 11, 16, 18, 31, 45 نشان داده شده اند…………………………………………………………………………………151

 

شکل4-2.طراحی اولیه ساختار اپی توپ های منتخب ، E1 تا E10 برای پروتئین L1 و  E11 تا E20  برای L2 طراحی شدند………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..155

 

شکل 4-3. آنالیز آنتی ژنی سیتی ساختمان توسط برنامه پروتئان آنالیز ،. این نتایج نشان داد که قسمت های اصلی ساختار پروتئنی جدید خصوصیات هیدروفیلیک دارد، بنابراین توان آنتی ژنیک را دارد……………………………………………………………157

 

شکل4-4. توالی ترجمه شده معکوس برای بهینه سازی کدون و کدون نادر برای افزایش سطح بیان ژن و انحلال پذیری پروتئین  ارزشیابی شد. به این منظور OPTIMIZER و سرورهای GenScript با هم بکار برده شدند…………………..158

 

ششکل 4-5. نتایج ترجمه معکوس و بهینه سازی …………………………………………………………………………………………………159

 

شکل 4-6.نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی و مشاهده باند در محدوده 45 کیلو دالتون……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….160

 

شکل4-7. pET28a(+)/HPV، SDS-PAGE قبل و بعد از تخلیص پروتئین ، نتیجه تخلیص به صورت تک باند و در محدوده 45KD است………………………………………………………………………………………………………………………………………….160

 

شکل4-8. نتایج Western Blot و SDS-PAGE ، نتیجه در محدوده 45KD است……………………………………………..161

 

شکل4-9. SDS-PAGE بعد از تخلیص انبوه پروتئین ، نتیجه به صورت تک باند و در محدوده 45KD است…………..162

 

فهرست جداول:

 

جدول 2-1. خصویات واکسن چهار ظرفیتی و دوظرفیتی HPV ……………………………………………………………………………….53

 

جدول 2-2.واکسن های پیشگیری کننده در حال توسعه……………………………………………………………………………………………61

 

جدول2-3.واکسن های درمانی HPV درحال توسعه………………………………………………………………………………………………..62

 

ﺟﺪول2-4.ﭘﺎﯾﮕﺎه داده اپی توپ ها و ﺳﺎﺧﺘﺎرهای آﻧﺘﯽ ﺑﺎدی ﺑﺮای ﺳﻠﻮل B ﻣﺨﺘﻠﻒ ……………………………………………………..72

 

ﺟﺪول 2-5. ﺗﻌﺪادی از اﺑﺰارهای ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮل B ………………………………………………………….75

 

ﺟﺪول 2- 6 . ﻣﻨﺎﺑﻊ ﻣﻮﺟﻮد جهتﭘﯿﺸﮕﻮﯾﯽ اپی توپ هایﺳﻠﻮلB  ……………………………………………………………………………80

 

جدول3-1. سکانس های استفاده شده برای طراحی ساختار کاندید یونیورسال واکسن HPV……………………………………..105

 

جدول3-2.گروه بندی موش های مورد مطالعه………………………………………………………………………………………………………141

 

جدول 4-1. پیش بینی اپی توپ سروتیپ های HPV 11.16.18, 31, 45 با استفاده از سرور BCPREDS……………….149

 

جدول 4-2.فهرست نتایج مدل سازی همولوژی برای پروتئین های L1 از HPV نوع های 11، 16، 18، 31 و 45………..150

 

جدول4-3. امتیاز و محدوده آسپاراژین در توالی اپی توپ ها را نشان  می دهد…………………………………………………………153

 

جدول4-4. 20  اپی توپ مناسب انتخاب شده از پروتئین های L1 و L2  ………………………………………………………………154

 

جدول 4-5. نتایج طراحی پروتئین و محاسبه پارامترهای مربوطه……………………………………………………………………………..156

 

 

1-7-5-1-1- داکتینومایسین……………………………………………………………………………………………………..11

 

1-7-5-2-آنتراسیکلین………………………………………………………………………………………………………………13

 

1-7-5-2-1-دانوروبیسین………………………………………………………………………………………………………….14

 

1-7-5-2-2-دوکسوروبیسین هیدروکلراید…………………………………………………………………………………..16

 

1-7-5-3- میترامایسین………………………………………………………………………………………………………………17

 

1-7-5-4 بلئومایسین سولفات…………………………………………………………………………………………………….19

 

1-7-5-5- میتومایسین‌ها……………………………………………………………………………………………………………21

 

1-7-5-5-1 میترامایسین C………………………………………………………………………………………………………..22

 

1-7-5-6- استرپتوزوستین…………………………………………………………………………………………………………22

 

1-8-سرطان ریه………………………………………………………………………………………………………………………..23

 

1-8-1- علائم سرطان ریه……………………………………………………………………………………………………….. 26

 

1-8-2- سرطان در ایران…………………………………………………………………………………………………………… 26

 

1-9-اکتینومیست‌ها…………………………………………………………………………………………………………………….28

 

1-9-1-متابولیت‌های ثانویه‌ی اکتینومیست‌ها………………………………………………………………………………….30

 

1-10-هدف از پژوهش………………………………………………………………………………………………………………33         

 

فصل دوم: پیشنه‌ی تحقیق                                                                                               

 

فصل سوم: مواد و روش­ها                                                                                              

 

3-1- ترکیبات استفاده شده………………………………………………………………………………………………………….39

 

3-2- دستگاه های استفاده شده……………………………………………………………………………………………………42

 

3-3- سویه‌های اکتینومیست………………………………………………………………………………………………………..43

 

تولید اسپور باکتری………………………………………………………………………….43

 

3-5- آماده‌سازی محیط پیش کشت………………………………………………………………………………………………44

 

3-6- آماده‌سازی محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………………………………44

 

3-7- احیا و کشت سویه…………………………………………………………………………………………………………….45

 

3-8- تهیه پیش کشت……………………………………………………………………………………………………………… 45

 

3-9- تولید متابولیت‌ها………………………………………………………………………………………………………………45

 

3-10- استخراج متابولیت‌ها………………………………………………………………………………………………………45

 

3-11- نگهداری عصاره‌ها………………………………………………………………………………………………………..46

 

3-12-1- کشت آرتمیا……………………………………………………………………………………………………………..46

 

3-12-2- آزمون ارزیابی سمیت در آرتمیا…………………………………………………………………………………..47

 

3-13- غربالگری ثانویه، ارزیابی سمیت در کشت سلولی……………………………………………………………..48

 

3-13-1- انتخاب دودمان سلولی…………………………………………………………………………………………….. 48

 

3-13-1-1 محیط کشت………………………………………………………………………………………………………….49

 

3-13-1-1-1- مراحل تهیه محیط کشت دودمان سلولی A549…………………………………………………..49

 

3-13-1-1-2-تجدیدکشت دودمان سلولی A549……………………………………………………………………..50

 

3-13-1-1-3- شمارش سلول‌ها و بررسی میزان فعالیت سلول…………………………………………………..51

 

3-13-2- تهیه محلول تریپسین………………………………………………………………………………………………….52

 

3-14- آزمون MTT………………………………………………………………………………………………………………..53

 

3-15- شمارش سلول برای انجام آزمونMTT……………………………………………………………………………54

 

ژوهش……………………………………………………………………….54

 

 

3-17- بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها تیمار شده با عصاره اکتینومیست‌ها……………………………………..55

 

3-18- شناسایی سویه‌های منتخب اکتینومیست………………………………………………………………………….56

 

3-18-1- بررسی مورفولوژی میکروسکوپی……………………………………………………………………………. 56

 

3-18-2- بررسی میسلیوم‌های هوایی و آرایش زنجیره اسپوری……………………………………………………56

 

3-18-3- بررسی رشد میسلیومی در محیطISP2 broth………………………………………………………………56

 

3-19-  مطالعه شیمیوتاکسونومی………………………………………………………………………………………………56

 

3-19-1- تهیه بیومس برای تعیین ایزومر دی آمینوپامیلیک اسید(DAP)……………………………………………56

 

3-20- شناسایی توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA سویه‌های منتخب…………………………………………….. 58

 

3-20-1- تهیه محیط کشت Luria Broth(LB)……………………………………………………………………………..58

 

3-20-2- تهیه زیست توده برای مطالعات فیلوژنتیک……………………………………………………………………..59

 

3-20-3- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………………59

 

3-20-4- تائید بررسی کیفیت استخراج DNA………………………………………………………………………………61

 

3-20-4-1- تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………………..61

 

3-20-4-1-1- تهیه بافر(TAE)Tris-Acetate-EDTA………………………………………………………………..61

 

3-20-5- انجام فرایند واکنش زنجیره پلیمراز(PCR)……………………………………………………………………..62

 

3-20-5-2- شرایط واکنش PCR………………………………………………………………………………………………62

 

3-20-5-3- بررسی محصولات PCR………………………………………………………………………………………..63

 

3-20-5-4- خالص سازی محصولات PCR……………………………………………………………………………….63

 

3-20-6- تعیین توالی نوکلئوتیدی قطعات تکثیر شده از ژن 16S rRNA………………………………………….63

 

3-20-7- مقایسه توالی نوکلئوتید ژن 16S rRNA سویه‌های اکتینومایست منتخب…………………………….63

 

فصل چهارم: نتایج                                                                                                       

 

4-1- شرایط پیش تخمیر و تخمیر و میزان متابولیت تولید شده توسط40 سویه  اکتینومیست‌ بررسی شده در این پژوهش………………………………………………………………………………………………………………………………65

 

4-2- نتایج حاصل از تست ارزیابی سمیت متابولیت‌های ثانویه………………………………………………………..68

 

4-3- نتایج مربوط به بررسی ریخت شناسی سلول‌ها در تست سمیت سلولی………………………………….. 71

 

4-4- نتایج مربوط به تست سمیت سلولی با روش MTT……………………………………………………………….72

 

4-5- بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها پس از تیمار با عصاره سویه‌ی اکتینومیست‌های منتخب………………74

 

4-6- شناسایی اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………………………………..74

 

4-6-1- بررسی ریخت شناسی اکتینومیست‌های منتخب…………………………………………………………………74

 

4-6-3- بررسی فیلوژنتیکی اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………………77

 

4-6-3-1- تائید استخراجDNA اکتینومیست‌های منتخب………………………………………………………………77

 

4-6-4- تائید استخراج ژن16S rRNA از ژل آگاروز……………………………………………………………………..77

 

4-6-4-1- نتایج مربوط به توالی خوانی ژن 16S rRNA……………………………………………………………….78

 

 فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری                                                                                      

 

 منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 91

 

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………101

 

پیوست‌ها………………………………………………………………………………………………………………………….102

 

فهرست جداول

 

عنوان                                                                                                                  صفحه

 

جدول ‏1‑1: میزان شیوع و مرگ و میر ناشی از انواع سرطان در هر دو جنس زن ومرد. 25

 

جدول ‏1‑2: تغییرات تنوع سرطان در ایران در طی سال‌های 1376-1318.. 27

 

جدول ‏1‑3:گروه‌های مختلف اکتینومیست‌ها 29

 

جدول ‏1‑4: تعدادی از متابولیت‌های استخراج شده توسط اکتینومیست‌ها 32

 

جدول ‏3‑1:مواد شیمایی استفاده شده 39

 

جدول ‏3‑2:دستگاه‌های استفاده شده 42

 

جدول ‏3‑3:ترکیبات محیط کشت ISP2 اصلاح شده 44

 

جدول ‏3‑4:ترکیبات محیط پیش تخمیر. 45

 

جدول ‏3‑5:نمک‌های مورد نیاز برای تهیه آب نمک دریایی مصنوعی.. 46

 

جدول ‏3‑6:ترکیبات مورد استفاده درتهیه محیط کشت دودمان A549. 49

 

جدول ‏3‑7:ترکیبات محیط کشت… 58

 

جدول ‏4‑1:نتایج حاصل از مرحله ی تولید واستخراج متابولیت‌های ثانویه. 64

 

جدول ‏4‑2:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 40-59% (محدوده اثر خوب). 67

 

جدول ‏4‑3:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 39-20% (محدوده اثر متوسط). 69

 

جدول ‏4‑4:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین 0-19% (محدوده اثرضعیف). 70

 

جدول ‏4‑5: نتایج مربوط به بررسی مرفولوژی سلول پس از تیمار با عصاره‌ها 70

 

جدول ‏4‑6: نتایج مربوط به مقایسه مقدار جذب بین عصاره‌ها با شاهد…………………………………………….. 72

 

جدول ‏4‑7: شماره دسترسی در Gene Bank ومیزان تشابه اکتینومیست‌های منتخب با اکتینومیست‌های ثبت شده براساس ترادف نوکلئوتید‌های ژن 16S rRNAدر ژنوم…………………………………………………………… 80

 

فهرست نمودارها

 

عنوان                                                                                                                  صفحه

 

نمودار ‏4‑1:مقایسه میانگین مقدار جذب بین عصاره‌های سویه‌هایی که 05/0≥p داشتندبا شاهد(A549). 73

 

فهرست اشکال                           صفحه

 

شکل ‏1‑1: ساختمان شیمیایی داکتینومایسین.. 12

 

شکل ‏1‑2: ساختمان شیمیایی دانوروبیسین.. 14

 

شکل ‏1‑3: ساختمان شیمیایی دوکسوروبیسین.. 16

 

شکل ‏1‑4: ساختمان شیمیایی میترامایسین.. 17

 

شکل ‏1‑5:ساختمان شیمیایی بلئومایسین.. 18

 

شکل ‏1‑6:ساختمان شیمیایی میتومایسین.. 20

 

شکل ‏1‑7: ساختمان شیمیایی استرپتوزوستین.. 22

 

شکل ‏3‑1: این تصاویر به عنوان نمونه از میزان آسیب می‌باشد که برای درک بهتر هر مفهوم آسیب دیدگی……………………………………………………………………………………………………………………………………….54

 

 

2-8-1- برهم‌کنش حشرات و گیاهان میزبان-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—– 19

 

2-8-2- برهم کنش حشرات و پاتوژن‌ها-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد———- 21

 

2-8-3- مقاوت به حشره‌کش‌ها—– 22

 

2-8-4- روابط شکار- شکارگر- پارازیتوئید-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 23

 

2-8-5- سیستماتیک مولکولی—– 24

 

2-8-6- حشرات تراریخته———- 25

 

2-9- میکروستلایت‌ها یا توالی‌های ساده تکرار شونده———— 26

 

2-10- نشانگر ISSR و کاربرد آن در مطالعات گیاهی و جانوری— 30

 

2-11- منابع تغییرات و چند شکلی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 31

 

2-11-1- نمونه DNA————— 32

 

2-11-2- طبیعت آغازگرهای مورد استفاده:-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—– 32

 

2-11-3- روش کشف————— 33

 

2-12- کاربردهای تکنیک ISSR—- 34

 

2-12-1- انگشت‌نگاری ژنتیکی—- 34

 

2-12-2- تنوع ژنتیکی و آنالیز فیلوژنتیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—— 34

 

2-12-3- نقشه‌یابی ژنتیکی——– 34

 

2-12-4- تعیین فراوانی توالی‌های ساده تکراری (SSR)———- 35

 

2-12-5- مطالعه جمعیت‌های طبیعی و گونه‌زایی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 35

 

2-13- چشم انداز کاربرد ISSR در ژنتیک مولکولی————— 36

 

2-14- کاربرد نشانگر ISSR در حشره شناسی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 37

 

2-15- نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز—– 38

 

فصل سوم

 

مواد و روش‌ها——– 40

 

3-1- جمع آوری نمونه‌ها———— 41

 

3-2- استخراج DNA زنبور عسل— 43

 

3-3- تعیین کیفیت DNA استخراج شده-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——– 45

 

3-3-1- الکتروفورز DNA در ژل آگارز 1 درصد-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 45

 

3-3-2- بررسی غلظت DNA استخراج شده-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—– 46

 

3-3-3- رقیق سازی DNA استخراجی برای دستیابی به غلظت  ng/µl25—— 47

 

3-4- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز—– 47

 

3-5- الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 49

 

3-6- نمره دهی باندهای مشاهده شده روی آگارز نشانگر غالب ISSR———— 50

 

3-7- ورود داده‌های حاصل از ژل‌ها به نرم افزار اکسل————- 51

 

3-8- اندازه گیری فواصل و تشابه‌های ژنتیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد—- 54

 

3-9- روش های گروهبندی داده ها-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————— 55

 

3-10- تجزیه خوشه ای————- 56

 

3-11- نیکویی برازش خوشه بندی یا ضریب کوفنتیک———– 56

 

3-12- تجزیه به مولفه های اصلی— 57

 

3-13- آنالیز داده‌های مولکولی—– 58

 

3-14- بررسی‌های مورفولوژیکی—- 58

 

 

3-15- تجزیه به مؤلفه اصلی——– 60

 

3-16- آنالیز داده‌های مورفولوژیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 61

 

فصل چهارم

 

نتایج—————– 62

 

بررسی تنوع مرفولوژیکی نژادهای زنبور عسل مورد مطالعه——– 63

 

4-2- نتایج مربوط به هفت صفت ظاهری اندازه‌گیری شده روی زنبوران عسل پنج استان ایرانبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 63

 

4-3- همبستگی خصوصیات ظاهری زنبور عسل پنج استان ایران—————- 64

 

4-4- ماتریس‌های شباهت و تفاوت بین زنبورهای پنج استان مختلف ایران—— 65

 

4-5- تجزیه خوشه‌ای و تجزیه به مولفه‌های اصلی بر اساس داده‌های مرفومتریکبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————— 66

 

4-6- بررسی تنوع ژنتیکی نژادهای زنبور عسل مورد مطالعه—— 67

 

4-7- تعداد باندهای تولیدی هر آغازگر برای زنبورهای استان‌های مورد مطالعه– 72

 

4-8- تعداد باندهای تولیدی در هر نژاد زنبور عسل—————- 72

 

4-9- تعداد باندهای تولید هر آغازگر و کارایی آنها در تکثیر—— 73

 

4-10- ماتریس‌های شباهت و تفاوت بین زنبورهای پنج استان مختلف ایران—- 74

 

4-11- تجزیه خوشه‌ای و تجزیه به مولفه‌های اصلی بر اساس داده‌های مولكولی– 74

 

4-12- بررسی شاخص نشانگری و قدرت تمایز آغازگرهای مورد مطالعه روی زنبور عسلبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——- 76

 

4-13- تعداد کل جایگاه‌های ژنی و تعداد جایگاه‌های ژنی  چندشکل در زنبورهای مورد مطالعهبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد- 77

 

4-14- دندوگرام اجماعی حاصل از داده‌های ژنتیکی و مرفومتریک————— 78

 

فصل پنجم

 

بحث و نتیجه‌گیری— 79

 

چگونگی کاربرد و آنالیز نشانگر ISSR در تنوع ژنتیکی زنبور عسل- 81

 

بررسی تنوع ژنتیکی نژادهای زنبورعسل مورد مطالعه————- 87

 

پیشنهادات:———- 90

 

منابع—————– 91

 

فهرست جداول

 

جدول 2-1: نام‌های متفاوت و همنام تکنیک ISSR-PCR- 31

 

جدول3-1: مکان‌ و آدرس‌های محل نمونه برداری زنبور عسل- 42

 

جدول 3-2 مواد واكنش، ‌حجم و غلظت نهایی اجزای واكنش زنجیره پلیمراز 48

 

جدول3-3: صفات مرفولوژیک اندازه‌گیری شده 59

 

جدول 4-1: میانگین هفت صفت مرفولوژیک زنبوران کارگر مورد مطالعه- 63

 

جدول4-2: اندازه هفت صفت مرفولوژیک زنبور عسل پنج استان ایران- 64

 

جدول 4-3: همبستگی بین صفات ظاهری اندازه‌گیری شده در زنبور عسل- 65

 

جدول 4-4: ضریب فاصله مرفولوژیکی  و تشابه مرفولوژیکی بین پنج جمعیت زنبور عسل- 65

 

جدول 4-5: لیست آغازگرها، توالی آنها و چند شكلی مشاهده شده در نژادهای زنبور عسل- 68

 

جدول 4-6: تعداد باندهای تولیدی هر آغازگر برای زنبورهای استان‌های مورد مطالعه- 72

 

جدول 4-7: ضریب تشابه ژنتیکی و فاصله ژنتیکی بین پنج جمعیت زنبور عسل  بر اساس نشانگر ISSR- 74

 

جدول 4-8: میزان برخی شاخص‌های آغازگرهای مورد استفاده در مطالعه تنوع ژنتیکی زنبور عسل- 76

 

فهرست اشکال

 

شکل 2-1: نقاشی کشف شده از زنبورداری در والنسیای اسپانیا 6

 

شکل 2-2: طبقه بندی انواع نشانگرهای ژنتیکی- 17

 

شکل3-1: پنج استان جمع آوری نمونه‌ی زنبور عسل- 41

 

شکل3-2: نمایی از مکان‌های جمع آوری نمونه‌های زنبور عسل- 42

 

شکل 3-3: دستگاه حمام آب مورد استفاده در این آزمایشات– 43

 

شکل 3-4: دستگاه سانتریفیوژ مورد استفاده در این آزمایشات– 44

 

شکل 3-5: بررسی کیفیت DNA استخراج شده ژنومی روی ژل آگارز 1 درصد- 46

 

شکل 3-6: دستگاه نانودراپ اسپکتروفوتومتر مورد استفاده در تعیین غلظت DNA- 47

 

شکل 3-7: برنامه واكنش زنجیره‌ای پلیمراز 49

 

شکل 3-8: دستگاه‌های PCR مورد استفاده در این آزمایشات– 49

 

شکل 3-9: تانک‌ الکتروفورز ژل آگارز مورد استفاده در این آزمایشات– 50

 

شکل 3-10: دستگاه BioDoc Analyzer و سیستم تصویربرداری از ژل آگارز 50

 

شکل 3-11: باندهای موجود و نمره‌دهی لوکوس‌های موجود حاصل از تصویربرداری ژل‌های آگارز نشانگر ISSR- 51

 

شکل 3-12: ورود داده‌های حاصل از نمره‌دهی ژل‌های آگارز به نرم افزار اکسل جهت آنالیز- 51

 

شکل 3-13: نمایی از بال جلویی زنبور عسل و صفات اندازه‌گیری شده 60

 

شکل 3-14: دستگاه استریومیکروسکوپ مجهز به دوربین مورد استفاده در آزمایشات– 60

 

شکل 4-1: دندروگرام حاصل از آنالیز خوشه‌ای بر اساس روش UPGMA با ماتریس تشابهCorr   66

 

شکل 4-2: مقایسه زنبورهای عسل مورد بررسی با استفاده از روش تجزیه به مولفه‌های اصلی- 67

 

شکل 4-3: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 1  با استفاده از مارکر bp 50- 69

 

شکل 4-4: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 2 با استفاده از مارکر bp 50- 70

 

شکل 4-5: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 3 با استفاده از مارکر bp 50- 70

 

شکل 4-6: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 4 با استفاده از مارکر bp 50- 71

 

شکل 4-7: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 5 با استفاده از مارکر bp 50- 71

 

شکل 4-8: تعداد باندهای تولیدی در نژادهای زنبور عسل- 73