1-2-2- وکتورهای کلونینگ

برای این كه بتوان قطعه­ای از  DNAی دلخواه (موسوم به Insert DNA) را با استفاده از شرایط طبیعی (in vitro) تكثیر كرده و برای مطالعات بیشتر استفاده نمود، لازم است DNA را توسط مولكول­های وکتور به سلول­های مورد نظر انتقال داد. در غیر این صورت، عمل انتقال، تكثیر و یا استخراج  DNAی مورد نظر امكان­پذیر نمی­شود. نظر به این كه قطعات تكثیر شده همه با هم یكسان هستند، این نوع متدولوژی به همسانه­سازی DNA موسوم است. مولكول­های وکتور DNA (DNAVector) كه خود DNA می­باشند، بنا به داشتن توالی به خصوصی قادر هستند در سلول­های میزبان خود به تعداد زیادی تكثیر شوند. در این صورت قطعه  DNAی دلخواه نیز به همراه وکتور خود تكثیر می­شود.

وكتورهای DNA تنوع بسیار زیادی دارند. مهمترین عامل طبقه­بندی آنها میزان ظرفیت حمل DNA به سلول میزبان است. قطعات DNA را می­توان از چند نوكلئوتید گرفته تا بیش از صد هزار نوكلئوتید توسط وكتورهای مناسب همسانه­سازی نمود. به همین دلیل در طراحی اولیه باید ابتدا اندازه  DNAی مورد نظر را مشخص و وكتور مناسبی انتخاب نمود. پلاسمیدها، فاژ λ، کاسمید و کروموزوم­های مصنوعی مخمر(Yeast artification chromosom) از وکتورهایی هستند که بیش از سایر وکتورها مورد استفاده قرار می­گیرد(Larry and Champness, 2007).

مشخصات كلی وكتورهای كلونینگ

وكتورهای مختلف DNA با تنوع بسیار زیاد، شامل اندازه­ها و ظرفیت­های حمل مختلف موجود می باشند، ولی دارای نقاط مشترك اساسی ذیل هستند:

مبدا همانند­سازی

همه وكتورها دارای توالی­های ویژه­ای هستند كه توسط آنزیم DNA پلی­مراز سلول میزبان شناسایی شده و به تعداد بسیار زیادتر از ژنوم خود میزبان تكثیر می­شوند این توالی به مبدا همانند­سازی موسوم است و با Ori نشان داده می­شود. برخی وکتورها حاوی دو نوع Ori برای تكثیر در دو نوع سلول میزبان می باشند. همانند­سازی وكتور توسط DNA پلی­مراز سلول میزبان، در این ناحیه شروع و در دو جهت (Bi-directional) مخالف هم ادامه می­یابد.

نشانگرهای انتخابی

همه وكتورها حامل ژن­هایی هستند كه به واسطه ایفایش آنها می­توان وجود وكتور را به سهولت در داخل سلول میزبان ردیابی نمود. متداول­ترین نشانگرها، ژن­هایی هستند كه فرآورده آنها باعث بروز مقاومت در برابر آنتی­بیوتیك­های به خصوصی می­شود. در صورتی كه وكتور به داخل سلول میزبان حساس به یك آنتی­بیوتیك انتقال یابد، می­تواند در حضور همان آنتی­بیوتیك زنده مانده و رشد كند. انواع نشانگرهای رایجی كه مقاومت به آنتی­بیوتیك به خصوصی را در سلول میزبان القاء می­كنند، آمپی سیلین[3]، تتراسایكلین[4]، جنتامایسین[5]، كانامایسین[6] و استرپتومایسین[7] می­باشند.

نشانگرهای ژنتیکی

دسته دیگری از نشانگرها، ژن­هایی هستند كه عامل كنترل یك سری واكنش­های بیوشیمیایی هستند. و در حضور مواد زمینه خاصی واكنش­های به خصوصی را بر­می­انگیزند. مثلاً ژن LacZ كه استفاده از آن بسیار متداول می­باشد در صورت انتقال به سویه­ای از باكتری E. coli كه این ژن را ندارد باعث تولید آنزیم بتا-گالاكتوزیداز می­شود كه می­تواند روی ماده­ای بنام X-Gal اثر کرده و رنگ آبی در محیط اطراف سلول تولید کند. برای تشخیص اینكه سلول میزبان حاوی وکتور DNA است، استفاده از یك نوع نشانگر كافی است ولی برای اینكه بتوان ماهیت وکتور را در رابطه با حامل بودن DNA وارد شده بررسی نمود، استفاده از نشانگرهای ثانوی ضروری می­باشد.

جایگاه کلونینگ متعدد (MCS)

برای اینكه بتوان DNA وارد شده را با استفاده از مكانیسم نوتركیبی[10] وارد قسمت خاصی از  DNAی وکتور کرد، در ساده­ترین روش كار لازم است با استفاده از آنزیم­های برش دهنده هر دو DNA را برش داده و قطعات برشی و سپس دو نوع DNA را به هم اتصال داد در وکتورهای جدید جایگاه کلونینگ یا MCS شامل توالی­هایی است كه حاوی توالی­های شناسایی و جایگاه برش برای آنزیم­های برش دهنده متعدد می­باشد. در کلونینگ باید از آنزیم­هایی استفاده كرد كه فقط می­توانند یكبار DNA وکتور را مورد برش قرار دهند به همین دلیل این جایگاه­ها را جایگاه برشی منحصر به فرد می­نامند. بنابر این MCS هر وکتور جایگاه برشی آنزیم­هایی را ارائه می­كند كه در تمامی طول وکتور منحصر به فرد[11] هستند. اگر­چه وجود MCS در یك وکتور الزامی است اما این جایگاه باید در مكان ویژه­ای در روی وکتور قرار گرفته باشد به طور رایج این محل در ناحیه ´5 ژن LacZ قرار دارد كه وجود آن در این محل در تولید فرآورده این نشانگر اختلالی ایجاد نمی­كند در صورت وارد كردن DNA در جایگاه MCS توالی این ژن مختل شده و عدم تولید كلونی­های آبی رنگ در حضور X-Gal وجود  DNAی وارد شده را نشان می­دهد.

جایگاه ­های پروموتر

بسته به هدف کلونینگ، وكتورهای متفاوتی طراحی شده­اند و به منظور انجام عملیات مختلف، توالی­های ویژه­ای در یك یا دو ردیف MCS قرار داده شده­اند. این توالی­های الیگو­نوكلئوتیدی محل شناسایی و كنترل آنزیم­های مختلف از منابع متفاوت هستند كه در سویه­های مختلفE. coli  موجود می­باشند. به این ترتیب بایستی برای اهداف و عملیات بخصوص، وكتور و سویه باكتری مناسب و سازگاری را انتخاب نمود. ممكن است هدف از کلونینگ تولید و تكثیر DNA هدف، تولیدmRNA  از  DNAی هدف یا این كه تولید فرآورده پروتئینی کد شونده از  DNAی هدف باشد. وجود پروموترهای ویژه و آنزیم­های مربوطه انجام این نوع عملیات را بر­عهده دارند.

مثلاً RNA polimerase از باكتریوفاژهای مختلف کلون شده و سویه­های ترا­ریخته E. coli حاوی این ژن­ها می­باشند. این نوع پلی­مرازها از  DNAهایی كه در مجاورت توالی پروموتور مخصوص شان قرار داشته باشند، به تعداد زیادی نسخه­برداری كرده و mRNA ی زیادی تولید می­شود. این نوع وكتور به وکتور نسخه­برداری موسوم است.