2-2- سویه‏های باکتری………………………………………………………………………..25

 

2-3- پلاسمیدهای مورد استفاده……………………………………………………………….26

 

2-4- محیط کشت باکتری‏ها…………………………………………………………………….26

 

2-5- آنتی‏بیوتیک‏ها……………………………………………………………………………27

 

2-6- طراحی آغازگر………………………………………………………………………….27

 

2-7- شناسایی و جداسازی باکتری Xcc…………………………………………………………………………………….29

 

2-8- خالص سازی DNA ژنومی باکتری Xcc سویه‏ی ………………………..NIGEB.088(A*)31

 

2-9- تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده……………………………………………….31

 

2-10- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با آنزیم‏هایTaq  و Pfu دی.ان.آ پلیمراز جهت جداسازی ژن‏های هدف……………………………………………………………………………………………………………………………………..31

 

2-11- الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………33

 

2-12- خالص‏سازی محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز………………………………………….33

 

2-13- جداسازی محصول PCR و یا محصول حاصل از هضم آنزیمی از روی ژل آگارز……………34

 

2-14- هضم آنزیمی با آنزیم‏های محدود کننده تیپ …………………………………………..II35

 

2-15- الکتروفورز محصولات واکنش‏های هضم آنزیمی…………………………………………39

 

2-16- واکنش اتصال………………………………………………………………………….39

 

2-17- تکثیر پلاسمید………………………………………………………………………….42

 

2-18- اندازه‏گیری دانسیته نوری(OD) باکتری…………………………………………………..42

 

2-19- تکنیک Colony-PCR: غربالگری کلونی‏های نوترکیب……………………………………42

 

2-20- استخراج پلاسمید در مقیاس کم ……………………………………(Mini-Preparation)43

 

2-21- توالی‏یابی………………………………………………………………………………43

 

2-22- انتقال پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس با‏ استفاده از روش ذوب و انجماد…………………………………………………………………43

 

فصل سوم: نتیجه‏گیری و بحث

 

3- شناسایی باکتری Xcc (A*)……………………………………………………………………………………………………………………..47

 

3-1-  شناسایی به کمک تست بیماریزایی بر روی گیاه میزبان C.auratifolia…………………………………47

 

3-2-  شناسایی به کمک آغازگرهای اختصاصیMS+/MS-  و Xac01 / Xac02……………………………….48

 

3-3-  استخراج DNA ژنومی از باکتری XCC……………………………………………………………………………49

 

3-4-  تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراج شده………………………………………………50

 

3-5- تکثیر ژن‏هایhrpW  و hrpG با واکنش زنجیره‏ای پلیمراز………………………………….51

 

3-5-1-  طراحی آغازگرهای مناسب……………………………………………………………51

 

3-5-2-  بهینه‏سازی شرایط واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………51

 

3-5-3-  الکتروفورز محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز………………………………………….53

 

3-6-  تایید ناقل‏های کلونینگ و بیانی از طریق الگوهای برشی حاصل از هضم توسط آنزیم‏های برشی نوع II…………………………………………………………………………………………………………………………………….54

 

3-7-  همسانه‏سازی ژن‏هایhrpG  و hrpW در ناقل‏های کلونینگ (PGEM7zf(-) , pUC19)………….55

 

3-8-  تایید همسانه‏سازی ژن‏های هدف در ناقل‏های کلونینگ (pGEM7zf(-))،( pUC19)………………57

 

3-8-1-  واکنش کلونی PCR کلون‏های گزینش شده……………………………………………57

 

3-8-2-  تایید همسانه‏سازی ژن‏هایhrpW/G  در ناقل‏های کلونینگ با روش هضم آنزیمی…………58

 

3-8-3-  تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpW/G در ناقل‏های کلونینگ با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………………………………………………………………………………………………59

 

3-9- همسانه سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121………………………………………………………59

 

3-10- تایید همسانه سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121…………………………………………….62

 

3-10-1- واکنش کلونی PCR کلون‏های تشکیل شده……………………………………………62

 

3-10-2- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش هضم آنزیمی.63

 

 

3-10-3- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpW/G در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………………………………………………….64

 

3-11- توالی‏یابی……………………………………………………………………………..65

 

3-11-1- نتایج توالی‏یابی……………………………………………………………………..66

 

3-12- انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpG و pBI.hrpW به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس.67

 

3-13- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس……..67

 

3-13-1- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G با روش کلونی PCR…………………………..67

 

فصل چهارم: جمع‏بندی کلی و پیشنهادها

 

4- جمع‏بندی کلی نتایج……………………………………………………………………….70

 

4-1- پیشنهادها………………………………………………………………………………71

 

پیوست

 

5- دستورالعمل استخراج و خالص‏سازی DNA ژنومی باکتری xanthomonas citri pv. citri سویه 088(A*) NIGEB-……………………………………………………………………………………………………………………………………84

 

5-1-  محلول‏های لازم جهت استخراج DNA ژنومی……………………………………………84

 

5-1-1- مراحل استخراج DNA ژنومی…………………………………………………………85

 

5-1-2- روش اسپکتروفوتومتری………………………………………………………………86

 

5-1-3- الکتروفورز بر روی ژل آگارز………………………………………………………….87

 

6- الکتروفورز با ژل آگارز……………………………………………………………………………………. 88

 

6-1- نمای ساده از دستگاه الكتروفورز…………………………………………………………88

 

6-2- ژل آگارز……………………………………………………………………………….89

 

6-3- اتیدیوم بروماید………………………………………………………………………….89

 

6-4- بافر بارگزاری ژل آگارز………………………………………………………………….90

 

6-5- طرز تهیه محلول …………………………………………………………….TBE 0.5X91

 

6-6- طرز تهیه آگارز 1%……………………………………………………………………………………………..91

 

7- دستورالعمل خالص‏سازی فرآورده‏های تکثیر شده و قطعات DNA از روی ژل آگارز…………………92

 

7-1- خالص‏سازی فرآورده‏های تکثیر شده با کیت ……………………………………..Bioneer92

 

7-2- خالص‏سازی قطعات DNA از ژل آگارز……………………………………………………………………………93

 

8- دستورالعمل تهیه باكتری‏های مستعد برای پذیرش DNA خارجی…………………………………….95

 

8-1- تهیه سلول‏های مستعد E.coli……………………………………………………………………………95

 

8-2- دستورالعمل تراریزش باکتری مستعد به روش شوک حرارتی………………………………………………96

 

8-3- تهیه‏ی سلول‏های مستعد و انتقال پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpW و  pBI-hrpG به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس با استفاده از روش ذوب و انجماد……………………………………………………….97

 

9- استخراج پلاسمید در مقیاس کم از باکتری E.coli سویه DH5α……………………………………………..99

 

9-1- استخراج پلاسمید به روش دستی…………………………………………………………99

 

9-2- استخراج پلاسمید با استفاده از کیت MBST (دکتر شایان)…………………………………….101

 

9-3- روش تهیه محلول های IPTG و …………………………………………………X-Gal103

 

9-3-1- تهیه محلول ایزوپروپیل D-B تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)…………………………………………….103

 

9-3-2- تهیه 5 برمو-3 کلرو- اتیدولیل D-B گالاکتوزید (X-Gal)………………………………103

 

10- تهیه مایه تلقیح و بهینه‏سازی شرایط مایه‏زنی گیاه میزبان……………………………………………………..103

 

 

 

فهرست جداول

 

1-1- بیماریزایی فرم‏های مختلف شانکر روی چهار گونه از مرکبات………………………………….       12

 

1-2- مشخصات آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر و شناسایی………………………………………….     29

 

2-2- برنامه Multipelex PCR با آغازگر‏های MS+/MS-  و Xac01/Xac02………………………          30

 

3-2- ترکیب محلول مادری برای واکنش Multipelex PCR جهت شناسایی باکتری…………….         30

 

4-2- شیب‏ دمایی به‏کار رفته برای تعیین بهترین دمای اتصال با آنزیم Taq………………………….       32

 

5-2- ترکیب محلول مادری برای واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز……….         32

 

6-2- چرخه حرارتی به‏کار ‏رفته برای تکثیر نهایی با آنزیم pfu………………………………………….      33

 

7-2- شرایط واکنش هضم ژن hrpW و ناقل همسانه‏سازی مربوطه (pGEM7zf(-))…………….          36

 

8-2- شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل همسانه‏سازی مربوطه (pUC19)……………………..        36

 

9-2- شرایط واکنش دوتایی هضم آنزیمی جهت تایید ناقل‏های همسانه‏سازی ((-)pGEM7zf) و (pUC19)……………………………………………………………………………………………………………..     37

 

10-2– شرایط واکنش هضم دوتایی آنزیمی جهت تایید ناقل بیانی(pBI121)……………………..        37

 

11-2- شرایط واکنش هضم آنزیمی ژن hrpW و pBI121 جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل……………………………………………………………………………………………………………………….    38

 

12-2– شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل بیانی جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل…………………………………………………………………………………………………………………………. 38

 

13-2- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpG)…………………………………………………………..         40

 

14-2- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpW)……………………………………………………………       40

 

15-2- شرایط واکنش اتصال (pUC19-hrpG)…………………………………………………………….        41

 

16-2- شرایط واکنش اتصال (pGEM7zf(-)-hrpW)……………………………………………………         41

 

17-2- چرخه حرارتی به‏کار رفته برای واکنش کلونی PCR به منظور تایید همسانه‏سازی در وکتور بیانی……………………………………………………………………………………………………………………..   45

 

18-2- ترکیبات محلول مادری واکنش زنجیره‏ای کلونی PCR جهت تایید عمل همسانه‏سازی دروکتورهای کلونینگ و بیانی……………………………………………………………………………………     45

 

1-5- مواد و مقدار مورد نیاز جهت تهیه بافر Loading dye………………………………………………     9

 

فهرست شکل‏ها

 

1-3- تست بیماریزایی روی لیمو………………………………………………………………………………………………48

 

2-3- تست (Xaco1 / Xaco2 / MS+/MS) Multiplex PCR……………………………………………………..49

 

3-3- اکتروفورزDNA ژنومی استخراج شده بر روی ژل آگارز 1%………………………………………………..50

 

4-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با Taq دی.ان.آ پلیمراز و گرادیان دمایی جهت بهینه‏سازی بهترین دمای اتصال با پرایمرهای اختصاصی………………………………………………………………………………………………….53

 

5-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز برای تکثیر ژن‏های hrpG , hrpW با آغازگرهای اختصاصی و آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز………………………………………………………………………………………………………………………..53

 

6-3- الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگ و بیانی با آنزیم‏های برشی نوع II بر روی ژل آگارز 1%………………………………………………………………………………………………………………………………..54

 

7-3- هضم آنزیمی فراورده ژن‏هایhrpG  و hrpW جهت بازیابی از روی ژل آگارز)الف) و قطعات بازیابی شده(ب)………………………………………………………………………………………………………………………55

 

8-3- هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگpUC19  و pGM7zf(-) جهت بازیابی از ژل آگارز(الف) قطعات بازیابی شده(ب)……………………………………………………………………………………………………………………..55